生物信息学工具预测，种系特异性新生多肽相关复合物（NAC）的亚基会发生相分离

《BioSystems》：Germline-specific nascent polypeptide-associated complex (NAC) subunits are predicted by bioinformatics tools to undergo phase separation

果蝇生殖细胞特异性核糖体相关NAC复合体的相位分离驱动特征研究。通过生物信息学分析发现gNAC蛋白具有非典型氨基酸组成、低复杂度重复序列及扩展的 intrinsically disordered regions（IDRs），其FuzDrop自发相位分离预测得分达近极值。研究揭示gNAC存在显著密码子使用偏好，暗示翻译水平调控机制。这些特征表明gNAC通过IDRs介导的相位分离机制，可能组织生殖细胞特异性核糖体复合体，形成稳定的蛋白 folding 动态区，确保生殖细胞蛋白组的精准表达。

　　

奥克萨娜·V·加尔齐茨卡娅（Oxana V. Galzitskaya）|安娜·V·格莱金娜（Anna V. Glaykina）|米哈伊尔·尤里耶维奇·洛巴诺夫（Mikhail Yu. Lobanov）|尼基塔·V·多维琴科（Nikita V. Dovidchenko）

加马列亚流行病学与微生物学研究中心（Gamaleya Research Centre of Epidemiology and Microbiology），俄罗斯莫斯科，邮编123098

摘要

最近的研究在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中发现了与生殖细胞特异性相关的核糖体相关新生多肽复合体（Nascent Polypeptide-Associated Complex，简称NAC）的变体，称为生殖细胞NAC（gNAC）。这些变体的功能主要受内在无序区域（Intrinsically Disordered Regions，简称IDRs）的调控。已知这些区域通过相分离机制参与蛋白质复合体的组装和生物分子凝聚体的形成，并能通过翻译后修饰来调节蛋白质稳态。我们的研究旨在利用生物信息学方法确定gNAC蛋白的特定分子特征，以揭示其促进相分离的倾向。分析结果显示，gNAC蛋白具有几个与相分离驱动因素一致的特性：非典型的氨基酸组成；能够形成交叉β结构的低复杂性重复序列；以及在寡聚化过程中可能发生结构变化的延长无序区域；根据FuzDrop程序预测，其自发相分离的得分接近最高值。此外，我们还发现gNAC编码序列中某些氨基酸残基的密码子使用存在显著偏倚，这表明可能存在翻译水平的调控机制。综上所述，这些特征将gNAC蛋白定义为一类可能驱动相分离的独特因子。我们提出，gNAC可能通过相分离机制在生殖细胞中组织专门的核糖体复合体，例如在核糖体上形成蛋白质稳态凝聚体，从而确保生殖细胞特异性蛋白质组的忠实表达。

引言

新生多肽复合体（NAC）最早于1994年被发现（Wiedmann等人，1994年）。在真核生物中，NAC是一种位于核糖体附近并与新生多肽链相互作用的异二聚体。研究表明，NAC在蛋白质折叠过程中起着重要作用（Gamerdinger等人，2015年）。

最近的一篇综述文章描述了NAC作为真核生物蛋白质合成过程中核糖体上的调控中心的关键作用。NAC在核糖体上充当主控制器，确保新蛋白质在细胞中的正确“生成”和“命运”（Rabl和Deuerling，2025年）。NAC还参与将蛋白质输送到线粒体，并防止新合成的蛋白质聚集，直到蛋白质折叠成其天然状态（Rabl和Deuerling，2025年；Sabbarini等人，2025年）。

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的生殖细胞特异性NAC蛋白及其在生殖细胞中的作用已通过实验得到发现和表征（Kogan等人，2022年，2012年）。研究表明，NAC的α-和β-亚基的特化同源物仅在生殖细胞（胚胎和成体的生殖腺）中表达。这些同源物被称为gNAC（生殖细胞特异性NAC）。生殖细胞亚基与通用（体细胞）同源物的区别在于其N端和C端存在延长的内在无序区域（IDRs）。这些IDRs被认为是磷酸化和其他翻译后修饰的目标（Kogan等人，2022年）。同时敲低生殖细胞和通用α-亚基会导致不育和生殖腺发育受损。此外，对69种果蝇物种的系统发育分析显示，gNAC-β基因仅在黑腹果蝇群体中扩增，而在其他物种（如D. yakuba）中不存在（Kogan等人，2012年）。

值得注意的是，一项开创性研究表明，线虫C. elegans生殖细胞中的P颗粒表现得像液滴，其细胞内的定位受受控凝聚和溶解过程的调控（Brangwynne等人，2009年）。P颗粒是液相凝聚体，表现出液体的典型特性：聚集、形成液滴以及润湿表面。在胚胎极化作用下，P颗粒会在细胞后部凝聚并在前部溶解。这一过程由极性蛋白（MEX-5、PAR-1）的梯度调控，这些蛋白改变了P颗粒沿细胞轴的凝聚位置。P颗粒被认为是通过蛋白质与RNA之间的弱相互作用形成的生物分子凝聚体。它们的行为类似于液-液相变，这可能是细胞质组织的一种普遍机制（Brangwynne等人，2009年）。

Trcek等人使用先进的显微镜技术在果蝇卵细胞中证明了极性颗粒的液相特性（Trcek等人，2015年）。研究表明，特定的极性颗粒蛋白（Oskar、Vasa）在体外和体内都能驱动相分离（Trcek等人，2015年）。

因此，最近对染色质重塑复合体cBAF（典型BAF，mSWI/SNF亚型）的ARID1A/B亚基中的IDR区域的研究发现，其氨基酸序列包含一种特定的“语法”，即一组控制两个关键功能的特征：生物分子凝聚体的形成以及与伴侣蛋白（转录因子、共激活因子）的相互作用（Patil等人，2023年）。cBAF的凝聚依赖于ARID1A/B IDR中均匀分布的酪氨酸。与伴侣蛋白（如p300、MED、TEAD、NFI）的相互作用依赖于同一IDR中的丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺基块（A/G/Q基块）。有趣的是，这些功能是可分离的：其中一个功能受损不会影响另一个（例如，A/G/Q基块的突变会破坏相互作用但不会影响凝聚）。如果没有IDR或ARID结构域，cBAF将失去定位到特定基因组区域（增强子）、激活染色质可及性和调控基因的能力。用FUS或DDX4的IDR替换ARID1A的IDR可以恢复凝聚，但无法恢复功能相互作用或基因组定位，这突显了序列的特异性。ARID1A/B IDR区域不仅仅是“蛋白质噪声”，而是通过相分离和特定相互作用来调控cBAF复合体基因组定位和活性的功能性模块。

在Wang等人的研究中（2018年），通过实验方法（荧光显微镜、溶液浊度测量、离心）证明了在FUS蛋白家族中，极性酪氨酸（在类朊病毒结构域中丰富）与带电精氨酸（在RNA结合结构域中丰富）之间的相互作用负责液-液相分离（LLPS）。此外，将酪氨酸替换为苯丙氨酸、将精氨酸替换为赖氨酸会降低凝聚体的形成速率。研究还表明，某些氨基酸残基的存在决定了最终凝聚体的性质。例如，多肽链中甘氨酸含量的增加会增加流动性，而谷氨酰胺和丝氨酸会增加凝聚体的硬度（Wang等人，2018年）。

研究表明，类朊病毒结构域本身也能在细胞中诱导LLPS（Martin等人，2020年；Wang等人，2018年）。由于一些类朊病毒结构域不含精氨酸残基，因此推测类朊病毒结构域中的酪氨酸残基开始相互作用。在这种情况下，相分离的速率比类朊病毒结构域与RNA结合结构域相互作用时低一个数量级（Wang等人，2018年）。

在本文中，我们提出延长的gNAC IDRs参与了生殖细胞中通过液-液相分离（LLPS）形成蛋白质复合体和凝聚体，通过磷酸化和其他修饰调节蛋白质稳态，以及在生殖细胞高合成条件下协调核糖体上的翻译和蛋白质折叠。我们的研究旨在利用生物信息学方法揭示gNAC蛋白的独特特征，这些特征似乎参与了生物分子凝聚体的形成。

数据准备

gNAC的β-亚基由五个高度同源的基因拷贝编码，而α-亚基由单个基因CG4415编码。氨基酸序列取自Uniprot数据库（www.uniprot.org）：gNAC-α的记录为Q9VPV7，gNAC-βtes1的记录为Q9VY63，gNAC-βtes2的记录为Q9VY38，gNAC-βtes3的记录为B6VQA0，gNAC-βtes4的记录为Q86NT7，gNAC-βtes6的记录为Q8IR50，uncNAC-β的记录为Q9VPR2，普遍表达的α-亚基NAC-α的记录为Q94518，普遍表达的β-亚基NAC-β的记录为Q7KM15。

单体、四聚体等

结果与讨论

基本观点是，黑腹果蝇（D. melanogaster）的gNAC所具有的延长内在无序区域（IDRs）为复杂的蛋白质相互作用和翻译后修饰（PTMs，主要是磷酸化）以及生物分子凝聚体的形成提供了平台。我们试图找出这些蛋白质中负责这些功能的结构特征。

非严格重复序列是指在组成或间距上有所变化的氨基酸基序

结论

2022年发表的一项研究首次描述了黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的组织特异性NAC同源物（Kogan等人，2022年）。我们在本文中证明了黑腹果蝇中的生殖细胞特异性核糖体相关新生多肽复合体（gNAC）具有几个独特的特征，这些特征是能够驱动液-液相分离的蛋白质的经典标志。研究结果表明，IDR区域及其翻译后修饰起着关键作用

CRediT作者贡献声明

米哈伊尔·尤里耶维奇·洛巴诺夫（Mikhail Yurevich Lobanov）：可视化、数据分析、形式分析、数据管理。安娜·弗拉基米罗夫娜·格莱金娜（Anna Vladimirovna Glyakina）：可视化、软件使用、数据分析、形式分析、数据管理。尼基塔·弗拉基米罗夫维奇·多维琴科（Nikita Vladimirovich Dovidchenko）：软件开发、方法学研究、数据分析、形式分析、数据管理。奥克萨娜·瓦列里阿诺夫娜·加尔齐茨卡娅（Oxana Valerianovna Galzitskaya）：写作——审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、数据分析、概念化

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。

数据可用性

数据可应要求提供。

资助

本研究得到了政府资助，项目编号为075-00224-26-00和1021062311484-9（蛋白质及其复合体的生物信息学和蛋白质组学研究）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的研究工作。