《Biosensors and Bioelectronics》：Loop-recognition dual-hairpin competitive probes enabling a dual-ratiometric electrochemical platform for specific SNP discrimination and logic gate construction
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精准单碱基错配检测的竞争双发夹探针电化学传感策略。通过野生型探针形成抑制复合物和靶标特异性探针触发信号传导的竞争机制，结合环区空间约束放大热力学惩罚，显著提升SNP特异性识别。构建的双比率电化学传感器不仅实现高灵敏检测，还能将SNP与WT序列作为分子逻辑输入直接执行XOR、AND、OR运算，为精准基因诊断和智能生物计算提供新范式。|竞争双发夹探针|单碱基错配特异性增强|电化学传感策略|分子逻辑运算|精准基因诊断
魏张|唐翔|陈宇涵|郭睿|王蒙|杨西淼|邓卫平|张云山|冯宪忠|叶静|张迪明
中国科学院东北地理与农业生态研究所黑土保护与利用国家重点实验室，大豆分子设计育种重点实验室，中国长春130102
摘要
由于完全匹配的序列与单碱基错配序列之间的热力学差异极小，准确区分单核苷酸多态性（SNPs）在核酸生物传感中仍然是一个基本挑战。这一固有限制常常会损害初始杂交阶段的识别准确性，无论后续采用何种信号放大策略。本文提出了一种基于竞争性环状识别双发夹探针的电化学生物传感方法，用于高特异性SNP的检测。该方法利用野生型（WT）捕获探针形成抑制复合物（HW/WT），有效抑制背景干扰，而目标特异性探针与SNP结合形成触发复合物（HS/SNP），从而启动信号转导。通过将识别结构域置于环区内部，触发复合物的形成受到显著的结构约束，从而显著放大了单碱基错配带来的热力学惩罚。基于这种增强的竞争性识别能力，构建了一种具有高鲁棒性和特异性的双比率电化学生物传感器，以实现可靠的SNP检测。此外，得益于抑制-触发机制的卓越单碱基分辨率，SNP和WT序列可直接作为分子逻辑输入，实现异或（XOR）、与（AND）和或（OR）逻辑运算。这项工作展示了如何在信号放大之前通过结构调控和竞争性分子分选，将微妙的遗传变异转化为可靠的分析和计算信号，为精确的核酸分析和智能生物计算提供了一个多功能生物接口。
引言
单核苷酸多态性（SNPs）是指基因组序列中的单碱基变异，是最常见的遗传变异形式之一，与疾病易感性、治疗反应和个性化医疗密切相关（Zuo等人，2025；Yano等人，2025；Lin等人，2025；Xiong等人，2024）。因此，准确区分SNPs对于生物传感和临床诊断至关重要（Maslov等人，2022；Rivera等人，2024；Tan等人，2025；Kovaka等人，2025；Nguyen等人，2024）。然而，可靠地识别单碱基错配仍然具有内在挑战性，因为完全匹配的DNA双链与错配DNA双链之间的热力学差异通常非常小（Hu等人，2025；Huang等人，2026；Liu等人，2025；Shi等人，2025）。从生物传感的角度来看，这一挑战不仅源于信号转导或放大效率的限制，更根本地源于初始目标探针杂交过程（Wang等人，2025；Zhao等人，2025a；Liu等人，2024）。在许多传感平台上，单碱基错配引入的自由能惩罚不足以在实际检测条件下保证选择性识别，从而导致特异性降低（Tan等人，2025；Yu等人，2025a；Yu等人，2025b）。因此，大多数现有策略侧重于下游信号放大，虽然提高了灵敏度，但往往无法解决初始识别阶段的选择性瓶颈问题。
发夹结构DNA探针因其构象切换行为、低背景信号以及与多种转导机制的兼容性而被广泛用于生物传感器的开发（Zhang等人，2025a；Cao等人，2025；Wu等人，2024）。近年来，人们已经巧妙地利用发夹探针的环区和茎部修饰来增强目标识别（Sha等人，2024；Gao等人，2024；Guo等人，2023），但大多数现有策略依赖于单探针架构。在这种传统系统中，野生型（WT）序列仅被视为由于热力学劣势而无法结合的被动干扰因素（Liu等人，2026；Sheng等人，2022；Zhao等人，2025b）。然而，一个持续的挑战是，这种“被动规避”机制在复杂矩阵中往往效果不佳。同时，另一个持续存在的挑战是，在复杂矩阵中实现卓越的单碱基分辨率通常仅靠单个环的结构约束是无法实现的，特别是当目标被过多的野生型序列淹没时。
在这项工作中，我们提出了一种基于竞争性环状识别的结构引导SNP生物传感策略，在信号放大之前实现增强的单碱基区分（图1）。该方法利用双发夹系统，将识别序列策略性地置于环区内，建立热力学过滤器。具体而言，野生型捕获探针（HW）专门捕获WT序列，形成稳定的抑制复合物，有效抑制背景干扰和脱靶激活。同时，目标SNP与其对应探针（HS）结合形成功能触发复合物，启动后续信号级联反应。通过在环区内强制这些初始杂交事件发生，触发复合物的形成对碱基配对准确性高度敏感。这种竞争性设计有效地将匹配和错配目标之间的微小热力学差异转化为显著的动力学和能量障碍，从而在实际传感条件下实现稳健可靠的SNP区分。基于这种抑制-触发识别机制，通过整合金纳米粒子辅助的信号转导和MnO2纳米酶介导的放大，构建了一种双比率电化学生物传感器。竞争性分子分选赋予的高内在选择性进一步使得单碱基差异能够作为独立的信息输入，允许在单一传感平台上实现DNA逻辑运算。通过强调放大前的结构调控和竞争性相互作用，这项工作为高精度SNP分析提供了一种实用且概念上通用的生物传感范式，具有在分子诊断和智能生物传感器设计中的潜在应用。
生物传感器检测SNP的原理
准确区分SNP和WT具有内在挑战性，因为单碱基错配引起的热力学惩罚通常不足以确保初始识别阶段的选择性杂交。为了解决这一根本限制，我们开发了一种基于环状限制的单碱基识别的竞争性双发夹系统，在信号转导之前放大错配引起的能量差异。
结论
总之，我们成功开发了一种以竞争性识别为先的电化学生物传感策略，通过双发夹架构优先考虑初始杂交的准确性，解决了精确SNP区分的基本挑战。与依赖下游信号放大来补偿低选择性的传统方法不同，我们的方法利用竞争性环状限制机制主动控制分子识别。
CRediT作者贡献声明
陈宇涵：方法学。
唐翔：写作——原始草稿，研究。
王蒙：方法学。
郭睿：研究。
冯宪忠：写作——审稿与编辑。
杨西淼：方法学，研究。
张云山：方法学。
邓卫平：方法学。
张迪明：写作——审稿与编辑，写作——原始草稿，项目管理，方法学，研究，资金获取。
叶静：写作——审稿与编辑，写作——原始草稿，方法学，研究。
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
本工作得到了吉林省自然科学基金（编号：YDZJ202501ZYTS374）、国家自然科学基金（编号：32501984）以及中国科学院研究项目（编号：E455S50501、E539S50401和E555S50101）的支持。
