AsCpf1中的脱靶外切核酸酶活性会削弱CRISPR诊断技术的效果

《Biosensors and Bioelectronics》：An Off-target Exonuclease Activity in AsCpf1 Undermines CRISPR Diagnostics

CRISPR-Cas系统研究揭示AsCpf1在Mg2+缓冲液中的非crRNA依赖性exonuclease活性导致检测灵敏度下降，3'端封尾技术有效缓解该问题并提升微RNA传感灵敏度。

　　

薛世星|孙赫|侯学艳|李楠|薛龙星|戴恩勇|万佳宇

吉林大学中日联合医院肿瘤与血液科，中国长春，吉林130031

摘要

CRISPR-Cas系统在分子诊断中的广泛应用源于其由crRNA引导的转切割能力。然而，基于AsCpf1的检测系统经常表现出无法解释的敏感度变化。本研究揭示，当在含有Mg²⁺的标准缓冲液中使用时，AsCpf1具有类似于外切酶I的独立于crRNA的功能。从结构角度来看，这种外切酶活性与RuvC结构域介导的典型转切割活性无关。通过结构建模预测，这种活性可能位于WED-PI结构域内。在诊断背景下，由于AsCpf1对目标DNA自由3'端的降解，有效靶标浓度降低，从而影响检测灵敏度。为了减轻这种干扰，我们证明了3'端加帽可以有效恢复检测性能。这种方法在基于CRISPR-EXPAR的microRNA生物传感器中得到了验证，加帽后灵敏度提高了约10倍。总体而言，这项研究揭示了AsCpf1系统中之前未被识别的外切酶活性，并建立了实用的设计标准，以提高基于CRISPR的诊断工具的稳健性和准确性。

引言

自从在细菌和古菌中发现成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）以来，CRISPR-Cas系统被认为是原核生物的关键适应性免疫机制[1],[2],[3]。2012年Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier等人展示了利用CRISPR-Cas9系统进行可编程DNA切割后，该领域进入了一个新时代[4]，随后Feng Zhang团队成功将这项技术应用于哺乳动物细胞的基因编辑，确立了CRISPR作为第三代基因编辑平台[5]。随着对II类CRISPR-Cas系统转切割活性的深入了解[6]，基于CRISPR的生物传感技术因高特异性、高灵敏度、快速响应和操作简便性而迅速发展，从而开发出了新的核酸检测平台，包括SHERLOCK[7]和HOLMES[8]。

在各种CRISPR系统中，Cpf1（Cas12a）是一种V型CRISPR-Cas核酸内切酶，已成为分子诊断中的关键工具[9],[10],[11],[12]。其重要性在于它能够通过单个crRNA实现靶向切割和启动转切割活性。与需要tracrRNA的Cas9系统不同，Cpf1的RNA引导系统更为高效，适用于低成本、高效率的检测应用[13]。

最近的研究表明，包括Cpf1在内的许多Cas蛋白在特定金属离子（如锰和镁）存在下可以表现出独立于crRNA的DNA切割活性[14]。一些研究将这种现象归因于金属离子诱导的RuvC内切酶结构域的非特异性激活[15]。这种“脱靶”活性对依赖镁离子作为必需辅因子的传统检测系统构成了重大挑战，可能会影响检测结果。

在此，我们系统地研究了AsCpf1在含镁条件下的非crRNA依赖性DNase活性。几十年来，CRISPR系统主要被描述为一种RNA引导的内切酶，这一观点得到了广泛研究的支持。然而，其潜在的外切酶活性一直未被充分研究或确认为一个独立的功能实体，始终被系统的主要内切酶功能所掩盖[16]。我们的发现表明，这种活性并非仅由RuvC结构域的功能增强产生，而是由wedged（WED）和PAM相互作用（PI）结构域共同介导的，其激活显著依赖于底物3′端的空间可及性。值得注意的是，我们证明了这种外切酶活性独立于crRNA引导的转切割途径。具有特定二级结构的底物的切割会负面影响检测灵敏度和特异性。为了减轻这种不利影响，我们提出了一种简单而有效的对策——用反向dT修饰或碱基互补性来封闭3'端，这可以完全恢复检测性能。为了突出其实际应用价值，我们基于指数等温扩增（EXPAR）技术设计了一种CRISPR生物传感器，加入这种保护性修饰后，检测灵敏度显著提高。这项研究不仅深化了对AsCpf1酶学特性的理解，还为设计稳健的基于CRISPR的诊断系统提供了实用指导。

章节片段

AsCpf1表现出独立于crRNA系统的非特异性单链DNA切割活性

对CRISPR-Cas12a系统检测灵敏度不一致性的研究揭示了AsCpf1中存在一种意外的核酸酶活性。在没有crRNA引导的情况下，Acidaminococcus sp. Cpf1（AsCpf1）能够切割特定的单链DNA序列，产生特定的切割产物。为了评估这种活性的序列特异性，我们检测了互补单链DNA及其对应的双链DNA（dsDNA）的切割效率[17]。图1A

讨论

最近的报告表明，包括FnCas12a、FnCas9和SpyCas9在内的几种Cas蛋白在二价金属离子（如锰）存在下可以无需RNA引导即可切割DNA[14]。同样，Bin Li等人观察到AsCpf1具有依赖于Mg²⁺的非RNA引导的核酸酶活性[15]。这些数据通常归因于金属离子诱导的RuvC催化核心的非特异性激活。然而，直接实验数据和对该现象的全面机制理解尚不充分

结论

总之，本研究系统地描述了AsCpf1蛋白中先前未被识别的非crRNA依赖性外切酶活性，并阐明了其潜在机制。这种活性选择性地降解具有可访问3′端的单链目标DNA，可能导致假阴性结果并降低检测灵敏度。尽管结构预测和生化证据支持WED-PI结构域的参与，但直接验证尚需进一步研究

CRediT作者贡献声明

侯学艳：撰写初稿、可视化、验证、软件开发、数据管理。李楠：资金获取。薛世星：撰写初稿、可视化、验证、软件开发、资源管理、项目规划、方法学设计、实验研究、数据分析。孙赫：软件开发、资源管理、项目规划、方法学设计、实验研究、数据分析。万佳宇：撰写修订稿、资金获取、概念构思。薛龙星：

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢薛龙星的基础支持。本工作得到了国家自然科学基金（项目编号：82301498）和吉林省科技发展计划（项目编号：20260204069YY）的财政支持。