电子转移驱动的超薄纳米酶与核酸扩增技术协同作用，用于膀胱癌筛查

《Biosensors and Bioelectronics》：Electron Transfer-Driven Ultrathin Nanozyme Synergizes with Nucleic Acid Amplification for Bladder Cancer Screening

敏感的电化学生物传感器通过整合CHA-HCR级联放大与氧空位丰富的超薄Au@MnO?纳米酶，实现膀胱癌标志物miR-21的超高灵敏度检测（检测限1.32 fM），准确区分癌患者与健康人群，且与PCR结果高度一致，为临床诊断提供可靠补充。

　　

张毅|刘璐萍|杨冰|吴琦|童辉|丁彩萍|陈亮|黄友菊

中国宁波大学附属人民医院

摘要

微小RNA-21（miR-21）是膀胱癌诊断的关键生物标志物，但其极低的丰度以及临床样本中的基质干扰阻碍了其准确检测。本文开发了一种灵敏的电化学生物传感器，该传感器结合了CHA-HCR级联扩增技术和富含氧空位（O_Vac）的超薄核壳Au@MnO₂纳米酶，用于临床miR-21的检测。Au@MnO₂表现出优异的氧化酶模拟活性：δ-MnO₂壳层中的氧空位形成了高效的电子转移路径（降低了环境敏感性），而Au核心则加速了电子转移，从而协同增强了信号强度。miR-21触发CHA扩增；其产物诱导HCR形成长链DNA，这些DNA被纳米酶捕获，通过掩蔽的活性位点实现高效的信号放大。在最佳条件下，该生物传感器的检测范围为10 fM-10 nM（检测限：1.32 fM），具有优异的选择性和稳定性。值得注意的是，该传感器能够在尿液样本中准确检测miR-21，其结果与PCR（核酸检测的金标准）高度一致，证实了其临床实用性。这种生物传感器为膀胱癌诊断提供了一个可靠的补充平台。

引言

根据2022年的全球癌症统计数据，膀胱癌（BCa）在全球恶性肿瘤发病率中排名第九（Bray等人，2024年）。根据肌肉侵袭程度，膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌（NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（MIBC）。NMIBC的高复发率和长期随访带来了巨大的监测和治疗成本。大约75%的膀胱癌患者最初表现为NMIBC，其中10%-25%的患者会进展为侵袭性更强的MIBC，预后较差：5年生存率仅为15%，中位生存时间为12-14个月（Lobo等人，2017年）。因此，迫切需要早期、明确、广泛适用且微创的膀胱癌诊断策略。

在各种与膀胱癌相关的尿液生物标志物中，miR-21已被证实是一种关键的致癌miRNA，具有独特的疾病特异性和显著的临床诊断意义（Gan等人，2024年）。从机制上讲，miR-21不仅通过直接下调p53肿瘤抑制通路来促进细胞转化和癌变（Catto等人，2009年；Papagiannakopoulos等人，2008年），还特异性地靶向多个与膀胱癌进展密切相关的下游肿瘤抑制基因。这种双重调控机制突显了它在膀胱癌发生和发展中的关键作用，进一步增强了其在早期筛查和术后监测中的临床应用价值。例如，miR-21直接抑制磷酸酶和tenin同源物（PTEN）的表达，而PTEN是PI3K/Akt信号通路的关键调节因子，在膀胱癌中经常失调；这种抑制作用会增强癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力（Lin等人，2019年）。此外，miR-21还下调程序性细胞死亡4（PDCD4）的表达，后者是凋亡的关键介质，有助于膀胱癌细胞逃避细胞死亡。

临床研究表明，多项荟萃分析和大规模队列研究验证了miR-21在膀胱癌诊断中的实用性。一项包含232名参与者的荟萃分析显示，miR-21的AUC为0.8517，灵敏度为75.86%，特异性为76.72%，无论是在早期（Ta-T1阶段，AUC = 0.8212）还是晚期（T2-T4阶段，AUC = 0.8832）膀胱癌中均表现良好。与健康个体和良性膀胱疾病患者相比，膀胱癌患者的miR-21表达显著升高（Yang等人，2024年），并且与肿瘤分期、分级和复发风险呈正相关。此外，陈的研究团队（Chen等人，2023年）报告称，尿液中的miR-21水平随膀胱癌进展而升高，最佳检测临界值为2.12 nM。综上所述，miR-21被确立为一种特异性强且具有临床相关性的膀胱癌早期检测和监测生物标志物。

尽管miR-21具有巨大的诊断价值，但其在校际尿液样本中的极低丰度仍然是实现灵敏检测的主要挑战（Xue等人，2022年）。电化学生物传感器由于其简单性、高灵敏度、微型化和低成本而适用于微量miRNA分析，非常适合即时检测（Chen等人，2023年；Gong等人，2023年；Wang等人，2022年；Wang等人，2016年；Xu等人，2025年）。核酸信号放大技术，如催化发夹组装（CHA）（Yang等人，2022年）和杂交链反应（HCR）（Yuan等人，2020年），可以通过等温、无酶和简便的反应实现微量目标信号的高效放大。CHA-HCR级联系统提供了协同放大效应，支持对低丰度miRNA的超灵敏检测（Hou等人，2021年；Xue等人，2022年）。然而，传感性能取决于高效的信号转导，需要与先进的纳米材料结合使用以克服传统传感器的局限性（例如，低氧化还原效率和较差的信号转换能力）。

纳米酶作为一种具有高催化活性、优异稳定性和易于修饰的酶模拟纳米材料，已成为解决上述问题的有希望的候选者（He等人，2020年；Jin等人，2022年；Li等人，2025年；Wang等人，2023年；Yang等人，2023年；Zandieh和Liu，2023年）。我们设计的超薄核壳Au@MnO₂纳米复合材料是一种理想的传感界面：Au核心提供高导电性以加速界面电子转移，而δ相MnO₂壳层对电活性物质表现出强烈的氧化酶模拟活性。Au@MnO₂丰富的活性位点使其能够特异性结合CHA-HCR产物，形成一个集成的“放大-催化”单元。具体来说，CHA-HCR级联扩增产生的双链DNA（dsDNA）产物通过Au-S键共价锚定在Au@MnO₂纳米酶上。同时，超薄MnO₂壳层的共轭结构通过π-π堆叠与dsDNA中的芳香环相互作用，这种非共价作用与Au-S键共同调节Au@MnO₂的活性位点。这种双重结合模式（共价Au-S键与非共价π-π堆叠）显著影响了Au@MnO₂的活性位点：它部分屏蔽了超薄MnO₂壳层上的MnO₂活性位点，并阻断了Au核心的催化位点，从而降低了纳米酶的整体催化性能。该单元稳定了核酸放大，通过高效催化将级联放大的生物信号转换为高强度电信号，实现了信号放大和信号转换的双重增强——从而克服了传统传感系统在低丰度miR-21超灵敏检测中的瓶颈。

本研究将CHA-HCR级联信号放大策略与超薄Au@MnO₂纳米酶结合，利用它们的强氧化酶模拟催化特性构建了一种新型电化学生物传感平台（图1）。该生物传感器实现了低至1.32 fM的检测限，能够清晰区分健康个体和癌症患者。此外，它表现出高灵敏度和优异的稳定性，适用于治疗监测。这种电化学生物传感器为复杂临床样本的实时分析提供了可靠的平台，具有重要的个性化癌症诊断和术中管理潜力。

部分内容摘录

Au@MnO₂的特性

首先通过溶剂热反应合成了柠檬酸稳定的金纳米球，然后通过将配体从柠檬酸替换为PVP制备了Au NPs-PVP，再与KMnO₄溶液反应制备了Ult Au@MnO₂纳米酶。粒径分析证实其具有超薄核壳结构，平均直径为136 ± 15 nm，Au核心直径为15 nm（图1A，D）。EDS映射显示Au集中在核心部分，Mn分布在壳层中，验证了核壳结构（图1G-I，S1A，B）。

结论

总结来说，本文成功开发了一种基于CHA-HCR级联反应的电化学生物传感器，该传感器通过Au@MnO₂纳米酶实现两步信号放大，用于灵敏的miR-21检测。其主要特点包括：（i）无酶的CHA-HCR DNA自组装，实现高效信号放大；（ii）Au@MnO₂的高氧化酶模拟活性，能够快速催化TMB并产生灵敏的电化学响应；（iii）优异的稳定性、重现性、选择性和

CRediT作者贡献声明

陈亮：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供、实验设计、概念构思。张毅：撰写 – 审稿与编辑、资源提供、实验设计、资金获取、数据管理。刘璐萍：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、实验设计、数据管理。黄友菊：撰写 – 审稿与编辑、资源提供、资金获取、概念构思。童辉：监督、资源提供、数据分析。丁彩萍：监督、资源提供。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可在本文的补充材料中找到。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢中国浙江省自然科学基金（LMS26B050007）、浙江省“先锋”和“领头雁”研发计划（2024C03195）、浙江省自然科学基金联合基金（LBY24H180007、ZCLKLY26H2001和LKLY25H200008）、浙江省医学与健康科技计划项目（2024KY1864、2025KY1974）以及国家自然科学基金（52222316）的财政支持。