在可普遍捕获的细菌表面通过电化学方法制备等离子体纳米结构，实现无标记且超灵敏的SERS（表面增强拉曼散射）病原体检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Electrochemically Engineered Plasmonic Nanostructuring on Universally Captured Bacterial Surfaces for Label-Free and Ultrasensitive SERS Pathogen Detection

快速灵敏无标记细菌检测新方法：通过4-MPBA官能化纳米柱SERS基材实现细菌特异性捕获，结合电化学金沉积在细菌表面形成等离子体热点，解决尺寸不匹配问题，检测灵敏度达1-100 CFU/mL，八种临床菌种可区分。

　　

金泰恩|李智英|文在元|全镇赫|杨俊英|李承勋|康海敏|朴成圭|李敏英

韩国材料科学研究院（KIMS）先进生物与医疗材料研究部，庆尚南道昌原市51508，大韩民国

摘要

由细菌引起的感染仍然是一个全球性的问题，这凸显了快速且高度敏感的诊断工具的迫切需求。本文介绍了一种双策略传感系统，该系统结合了4-巯基苯硼酸（4-MPBA）功能化的纳米柱表面增强拉曼光谱（SERS）基底和电化学SERS（EC-SERS）平台，实现了无标记且超灵敏的细菌病原体识别。4-MPBA的功能化能够特异性识别细菌细胞壁上的糖链部分，从而在2小时内促进细菌细胞在基底上的富集。随后在10分钟内进行的电化学金沉积在细菌表面生成均匀的等离子体热点，有效解决了细菌尺寸与SERS活性纳米间隙之间的空间不匹配问题。这种方法能够在1至100 CFU/mL的浓度范围内检测多种细菌物种，相比未经改性的基底提高了两个到四个数量级。此外，通过主成分分析（PCA）和支持向量分类（SVC）可以清晰地区分八种细菌物种。总体而言，4-MPBA功能化的SERS基底和EC-SERS平台为在复杂生物环境中快速、灵敏且无标记地识别多种细菌物种提供了一种有前景的策略。

引言

细菌病原体对全球健康、经济和食品安全构成了严重且日益增长的威胁。传统诊断方法的延迟和不准确性常常迫使临床医生在确定致病菌之前就使用广谱抗生素。然而，这种经验性方法加速了抗生素耐药性的发展，并降低了治疗效果。因此，多重耐药（MDR）菌株如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）迅速出现并传播，进一步加剧了全球抗菌素耐药性危机。如果这些感染得不到及时诊断和治疗，可能会迅速发展成危及生命的状况，如败血症。MDR细菌的影响不仅限于医院，它们可以通过直接接触、受污染的设备或内源性微生物群在免疫功能低下的患者中传播。在食品和水系统中，即使是微量的污染也可能导致大规模爆发和国际产品召回。面对这些日益严重的威胁，迫切需要快速、灵敏且特异的诊断工具，以指导临床、环境和工业领域的早期和针对性干预。 细菌检测传统上依赖于基于培养的方法，即将样本接种到选择性琼脂或肉汤培养基上以促进细菌生长并计数菌落。尽管这些方法是评估细菌活力和抗生素敏感性的金标准，但它们本质上耗时（通常需要1-3天的培养时间）且劳动密集，需要专门的实验室设施和受过培训的人员。此外，基于培养的检测方法难以检测不可培养或受压的细菌，并且不适用于多微生物环境，因为在这些环境中竞争性生长可能会掩盖目标物种。为了解决这些限制，已经开发了聚合酶链反应（PCR）和免疫测定等替代诊断技术。基于PCR的分子诊断方法提供了更高的灵敏度和更快的周转时间，但需要昂贵的仪器和受过培训的人员，并且通常无法区分存活和不可存活的生物体。免疫测定相对简单且快速，但受到交叉反应、在复杂生物样本中灵敏度低以及难以实现多重检测等问题的限制。值得注意的是，所有这些方法在应用于多微生物样本或细菌负荷较低的样本时都存在显著局限性。在血液、唾液或尿液等临床标本中，宿主来源的分子可能会掩盖或干扰目标信号。此外，当前的诊断工具往往在即时应用方面存在不足，无法满足ASSURED标准（经济实惠、灵敏、特异、用户友好、快速、稳健、无需设备且可交付给最终用户），这些标准定义了现实世界环境中理想诊断平台的特征。 为了克服传统检测方法的局限性，表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种强大的振动光谱技术应运而生，它通过纳米结构金属表面（通常由金（Au）或银（Ag）组成）的局域表面等离子体共振（LSPR）效应放大原本微弱的拉曼信号，实现了超灵敏和分子特异性的检测。这些等离子体基底生成高度受限的电磁“热点”，使拉曼散射强度增强高达10^8至10^14倍，从而实现单分子或单细胞检测。此外，分析物与金属表面之间的电荷转移相互作用（称为化学增强）也进一步增强了信号。由于这种双重机制，SERS产生了反映细菌目标内在分子组成的独特光谱指纹，包括核酸、蛋白质、脂质和色素，使其特别适合用于化学生物分类学分析。然而，将SERS应用于复杂生物样本时会遇到额外的挑战。在真实样本中，细菌与多种生物分子（如蛋白质、脂质和宿主细胞碎片）共存，这种复杂的生物基质会在SERS测量过程中产生显著的背景信号，导致光谱重叠，干扰细菌特异性拉曼指纹的检测。此外，细菌细胞相对较大的尺寸（通常为500纳米至1微米）与定义最强烈SERS热点的亚纳米级间隙存在根本的几何不匹配。这种尺寸差异限制了能够接近等离子体纳米结构的细菌表面组分的数量，从而降低了整体增强效果。此外，细菌细胞的三维结构还带来了另一个障碍：它们的厚度会阻碍激光在z方向的穿透，妨碍对底层等离子体基底的有效激发，进一步减弱了拉曼信号的增强。在低细菌浓度（1-100 CFU/mL）的情况下，这些挑战尤为关键，这在临床上与早期血液感染（如败血症）相关。克服这些多方面的限制对于将SERS发展为复杂现实世界环境中可靠的细菌检测工具至关重要。 在这项研究中，我们旨在解决基于SERS的细菌检测在复杂生物样本中的固有挑战。为了在低浓度条件下促进细菌的选择性捕获并提高在亚纳米级热点内的定位，我们用4-巯基苯硼酸（4-MPBA）对垂直排列的纳米柱SERS基底进行了功能化。这种功能化利用了硼酸与细菌细胞壁糖链的可逆结合，从而提高了细菌的捕获和富集效果，并使它们更接近电磁热点，生成更强烈且可重复的SERS信号。然而，细菌细胞相对较大的尺寸仍然限制了它们进入相邻金属纳米结构之间的纳米间隙，降低了增强效果。为了克服这种几何不匹配，我们进一步整合了电化学SERS策略，使用三电极系统将金属金纳米结构直接沉积在细菌表面。这种电化学沉积在每个细菌细胞周围形成了内部热点层，即使在低细菌浓度下也能显著提高SERS灵敏度。先前的电化学SERS研究已经证明，通过对预形成的等离子体基底施加电势，可以调节界面吸附、分子取向、电荷分布或氧化还原状态，从而增强来自细菌或分泌细菌分子的信号。此外，我们的团队还证明，电化学驱动的金生长可以在用拉曼报告基因功能化的合成DNA探针系统中增强SERS信号。然而，这些方法仅限于基底介导的界面调制或预定义的分子模型系统。迄今为止，还没有报道直接在完整细菌细胞表面工程化等离子体纳米结构以放大SERS信号的方法。与化学原位金生长策略相比，这里使用的电化学过程可以通过简单地切换施加的电势来精确控制金属成核的时间，从而实现更均匀的等离子体覆盖。由于不需要化学还原剂，电化学沉积还防止了残留试剂引起的拉曼背景，并在温和的水条件下保持了细菌膜的完整性。这种双重机制即使在超低细菌浓度下也能显著增强SERS信号强度。我们评估了该平台在八种临床相关细菌物种上的检测灵敏度和物种水平区分能力：大肠杆菌（Escherichia coli）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。总体而言，这种结合4-MPBA介导的细菌捕获与电化学形成内部等离子体热点的混合策略为在复杂生物基质中灵敏可靠的细菌检测提供了一个有前景的平台。

材料

聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜（厚度：250 μm）从Toray Advanced Materials Korea（首尔，韩国）购买。直径为4英寸的99.99%金（Au）溅射靶材从Taewon Scientific（首尔，韩国）购买。氯化钠（NaCl）、去离子水和99.9%乙醇从Samchun（庆尚北道平泽）购买。4-巯基苯硼酸（4-MPBA）（C6H7BO2S）从TCI（东京化学工业株式会社，东京，日本）购买。三氯化金（HAuCl4·xH2O）也从TCI购买。

细菌捕获和EC-SERS检测策略

为了实现无标记且超灵敏的细菌病原体检测，我们开发了一个基于电化学工程纳米柱（AENP）的平台，该平台包括纳米结构表面制备、化学表面功能化、细菌捕获和电化学金属沉积（图1）的顺序工作流程。

结论

在这项研究中，我们开发了一个基于3D金纳米柱阵列（AENP）的电化学工程SERS平台，用于无标记、超灵敏地检测和区分病原细菌。通过将4-MPBA表面功能化与10分钟内进行的电化学金沉积相结合（无需化学还原剂），该系统实现了细菌的选择性固定，并生成了内部和界面等离子体热点。

CRediT作者贡献声明

金泰恩：撰写——原始草稿、研究、数据管理、概念化。 文在元：方法学、研究。 李智英：撰写——原始草稿、方法学、研究、形式分析、数据管理。 杨俊英：软件、形式分析。 全镇赫：软件、数据管理。 李承勋：软件、形式分析。 李敏英：撰写——审稿与编辑、监督。 朴成圭：项目管理。

未引用参考文献

49.; 50.; 51.; 52.; 53.

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本研究报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国贸易、工业与能源部（MOTIE）资助的“技术创新计划”（RS-2024-00432381）、韩国国家研究基金会（NRF）的国家研发计划（由科学技术信息通信部资助，项目编号RS-2022-NR068135和NRF-2020R1A5A1018052），以及韩国材料科学研究院（KIMS）的基础研究计划（PNKB010）的支持。该研究还得到了韩国国家科学技术委员会（NST）的支持。