《Cellular Signalling》：CLDN18.2 in lung adenocarcinoma as a promising target of chimeric antigen receptor T cells
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CLDN18.2靶向CAR-T细胞疗法联合抗PD-1抗体显著抑制肺腺癌生长并激活免疫微环境。
Feng Xu|Haidi Xu|Yongkuan Gu|Ran Zhang|Hui Chen
天津医科大学肿瘤医院肺癌科，国家癌症临床研究中心，癌症预防与治疗重点实验室，中国天津 300000
摘要
目的
我们成功开发了一种针对Claudin 18.2 (CLDN18.2) 的自体嵌合抗原受体T (CAR-T) 细胞治疗方法，用于治疗肺腺癌 (LUAD)。
方法
通过结合大规模RNA测序数据集和免疫调节因子，我们确定了LUAD中的相关分子。为了验证CLDN18.2在调节T细胞浸润中的作用，我们使用CRISPR-Cas9技术在A549细胞培养模型中敲除了CLDN18.2基因，从而获得了CLDN18.2?/?克隆。我们在体外和体内对靶向CLDN18.2的CAR-T淋巴细胞进行了功能评估。最终，我们的目标是探讨是否可以通过联合使用抗PD-1抗体来进一步增强CLDN18.2导向的CAR-T细胞的抗肿瘤效果。
结果
研究表明，CLDN18.2是调节LUAD免疫反应的关键靶点。利用细胞和组织样本进行的验证实验确认，CLDN18.2在LUAD来源的细胞和组织中的表达水平升高。体外实验表明，敲低CLDN18.2可以抑制LUAD细胞的致癌能力。体内研究显示，CLDN18.2-CAR-T疗法能够显著减少肿瘤生长。CLDN18.2-CAR-T细胞将免疫抑制型肿瘤转化为免疫激活型肿瘤，与抗PD-1抗体联合使用时，这种治疗策略显著增强了抗肿瘤效果。
结论
我们的研究结果表明，CLDN18.2导向的CAR-T细胞作为治疗表达CLDN18.2的LUAD的有效策略具有潜力。
引言
肺腺癌 (LUAD) 是非小细胞肺癌 (NSCLC) 的主要亚型，其预后较差，5年总生存率仅为15%，约占所有肺癌病例的85% [1]，[2]。作为NSCLC中最常见的组织学亚型，LUAD导致了大约40%的肺癌相关死亡 [3]。尽管在手术、放疗、化疗尤其是靶向治疗方面取得了显著进展，但患者的总体生存率仍然不理想。早期治疗的LUAD患者5年生存率低于30%；而晚期疾病由于高度侵袭性和转移性，生存率进一步下降 [4]。因此，开发针对LUAD的新治疗方法具有重要的临床意义。
工程化嵌合抗原受体 (CAR-T) 的T淋巴细胞在血液系统癌症（如淋巴瘤和白血病）中表现出抗肿瘤活性 [5]，[6]。在实体瘤领域，CAR-T疗法也取得了进展，应用于乳腺癌 [7]、结直肠癌 [8]、甲状腺癌 [9] 和头颈部恶性肿瘤 [10]。在肺癌研究中，Jaspers等人开发了一种针对DLL3的CAR-T细胞疗法，在小鼠小细胞肺癌 (SCLC) 和异种移植模型中显示出抗肿瘤效果 [11]。此外，奥沙利铂/环磷酰胺与抗PD-L1的联合治疗能够协同增强CAR-T介导的肿瘤抑制和生存率，提高了ROR1特异性CAR-T细胞在LUAD中的疗效 [12]。目前，CAR-T疗法在实体瘤中的主要挑战之一是识别肿瘤特异性抗原。目前使用的多数肿瘤相关抗原 (TAAs) 缺乏绝对的肿瘤特异性。已经开发出多种策略来提高CAR-T细胞的控制能力，以减轻靶向/非靶向毒性和常见副作用 [13]，[14]。因此，筛选和鉴定合适的TAAs对于LUAD的治疗至关重要。
Claudin 18.2 (CLDN18.2) 属于紧密连接相关膜蛋白家族，该家族包含27种不同的蛋白质，作为精准肿瘤治疗的候选肿瘤相关抗原受到越来越多的关注 [15]。在良性组织中，CLDN18.2主要表达于胃上皮细胞的紧密连接复合体中，在维持上皮极性、介导细胞间粘附和调节细胞旁分子转运中起作用 [16]。在恶性转化过程中，上皮极性的破坏和致癌重编程导致CLDN18.2在紧密连接结构外的异常表达，在肿瘤细胞中频繁上调，从而表现出肿瘤优先表达的特性 [17]。目前，针对CLDN18.2的嵌合IgG1单克隆抗体zolbetuximab已在晚期或转移性胃癌和胃食管交界癌患者中显示出治疗活性 [18]，[19]。另一种自体CAR-T细胞疗法CT041在转移性胰腺癌及其他胃肠道恶性肿瘤患者的临床评估中也显示出良好的疗效 [20]，[21]。
在本研究中，我们开发了一种针对CLDN18.2的自体CAR-T细胞疗法，并在临床前肺腺癌模型中评估了其疗效。结果表明，CLDN18.2特异性的CAR-T细胞是治疗表达CLDN18.2的LUAD的有效方法。研究发现，CLDN18.2的表达促进了T淋巴细胞在LUAD组织中的浸润和存活。从机制上看，CLDN18.2增强了T淋巴细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，从而促进了细胞因子的分泌、细胞毒性和T细胞的活化。
部分内容摘录
CAR-T细胞的体外细胞毒性活性
关于CAR-T细胞生产和表面表型分析的详细方案见补充材料。使用Agilent xCELLigence实时阻抗监测系统在体外条件下量化了工程化T细胞的细胞毒性。每隔10分钟连续记录一次电阻变化，总监测时间为60至75小时。实验设置中，CAR-T细胞被接种在96孔eSight微孔板（Agilent）中
LUAD中CLDN18.2的上调
首先，我们分析了多种恶性肿瘤类型的CLDN18.2表达情况，发现多种癌症类型中均存在CLDN18.2的高表达（图S1）。免疫浸润分析显示，CLDN18.2的表达与多种癌症类型（包括LUAD）中不同免疫细胞的浸润状态相关。作为初步步骤，我们比较了人类LUAD细胞与邻近组织中CLDN18.2的表达差异
讨论
将CAR-T疗法扩展到实体瘤仍面临诸多挑战，这突显了需要改进其抗肿瘤效果的方法 [24]。Claudin家族成员 (CLDNs) 包含27种跨膜蛋白，与紧密连接相关，在建立细胞旁屏障、维持组织结构和支持器官特异性生物功能中起关键作用 [25]。其中，CLDN18.2尤其重要
结论
本研究表明，CLDN18.2是LUAD的一个有前景的免疫治疗靶点，新型CLDN18.2-CAR-T细胞构建体对CLDN18.2阳性的LUAD具有显著的抗肿瘤效果。这项研究为LUAD的免疫治疗提供了新的策略。
作者贡献声明
Feng Xu：撰写——初稿。Haidi Xu：数据可视化与验证。Yongkuan Gu：撰写——初稿，数据管理。Ran Zhang：撰写——初稿，数据可视化。Hui Chen：审稿与编辑。
伦理声明
天津医科大学肿瘤医院附属北方剧场总医院的伦理委员会批准了这项研究（NSFC-AE-2025437），研究严格遵循《赫尔辛基宣言》进行。
