在体外模型中，Adamts2基因的沉默可以抑制成纤维细胞介导的纤维化，并促进轴突再生

《Cellular Signalling》：Silencing Adamts2 attenuates fibroblast-mediated fibrosis and promotes axonal regeneration in an in vitro model

脊髓损伤后纤维化疤痕通过调控Adamts2表达影响轴突再生，单细胞测序筛选出Adamts2在损伤后显著上调，RNA干扰沉默Adamts2可抑制TGFβ介导的纤维化表型并激活AKT/ERK通路促进神经再生。

　　

陈晨|薛春红|李世英|吕叶华|刘伟

江苏省神经再生重点实验室与教育部联合创新中心、国家药品监督管理局组织工程技术创新产品研究评价重点实验室、南通大学医学院及临床创新研究中心、南通市中医院——南通大学，中国江苏省南通市226001

摘要

中枢神经系统损伤后形成的纤维化瘢痕对轴突再生构成了严重障碍。为了减弱纤维化瘢痕的抑制作用，许多临床前研究探讨了相关策略。成纤维细胞是形成纤维化瘢痕的主要细胞。在本研究中，我们首先利用单细胞测序数据分析了小鼠脊髓损伤后成纤维细胞的变化，并筛选出特异性高表达的基因Adamts2（具有血小板反应蛋白类型1基序2的金属蛋白酶）。随后，我们使用体外TGFβ诱导的成纤维细胞模型评估了Adamts2靶向RNAi在减弱成纤维细胞促纤维化表型方面的效果。研究发现，TGFβ增强了原代脊髓成纤维细胞中Adamts2的表达，并调节了与纤维化相关的基因表达。此外，沉默Adamts2可降低TGFβ在脊髓成纤维细胞中的促纤维化活性。机制上，成纤维细胞中Adamts2的敲低导致多种神经营养因子的上调，进而激活运动神经元中的AKT和ERK信号通路，从而减轻了对轴突生成的抑制作用。我们的结果表明，Adamts2特异性siRNA显著抑制了TGFβ诱导的促纤维化表型，并在共培养过程中减轻了其对运动神经元轴突生成的抑制效应。总体而言，这些结果表明抑制Adamts2能有效抑制成纤维细胞介导的纤维化，提示靶向Adamts2是通过促进神经支持性微环境来促进脊髓损伤后神经修复的有效治疗策略。

引言

脊髓损伤（SCI）是对中枢神经系统（CNS）的严重创伤性损伤，导致患者出现显著的神经功能障碍和感觉运动功能丧失[1]、[2]。SCI后，脊髓内的神经回路被破坏，阻碍了脑源性下行运动指令的有效传递，并损害了中枢模式发生器（CPG）的功能完整性[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]。目前，SCI治疗的主要目标是保护神经系统、改善微环境并促进神经元修复和再生[1]。研究表明，SCI后瘢痕微环境的形成与神经再生密切相关，影响身体的神经和运动功能恢复[10]。SCI后，损伤部位会形成复杂的结构，主要包括中央纤维化瘢痕和外围胶质瘢痕。来自血管和脑膜的成纤维细胞侵入损伤核心，在那里迅速增殖形成致密的纤维化组织。胶质瘢痕的作用目前仍有争议，但纤维化瘢痕作为一种物理和化学屏障，严格阻碍了轴突的生长。这种屏障长期存在于损伤中心，阻碍了再生[11]、[12]、[13]。因此，需要进一步研究如何减少纤维化瘢痕的形成，为轴突再生和神经元存活提供更多空间，以促进SCI后的功能恢复。此外，单细胞或单核RNA测序（scRNA-seq/snRNA-seq）技术已被广泛用于研究SCI后的细胞异质性和动态过程，揭示了损伤区域的时空病理变化和细胞相互作用[14]、[15]、[16]。这项技术的发展为我们的研究提供了有利条件。

转化生长因子β（TGFβ）是一种多功能细胞因子，是激活静止成纤维细胞的主要催化剂，促进其分化为肌成纤维细胞。TGFβ可以调节成纤维细胞的增殖、分化和凋亡，并影响成纤维细胞产生的细胞外基质（ECM）。TGFβ/SMADs信号通路是研究SCI后成纤维细胞激活和纤维化瘢痕形成的主要途径之一[17]。SMADs蛋白是TGFβ受体（TGFβR）的直接底物蛋白，参与并调节TGFβR的细胞信号转导。作为TGFβ/SMAD依赖性信号转导的核心介质，SMAD3通过磷酸化在TGFβ信号通路中被激活[18]。

具有血小板反应蛋白类型1基序2的ADAM金属蛋白酶（Adamts2）属于ADAMTS家族。ADAMTS家族是一组分泌型锌依赖性金属蛋白酶，在细胞外基质代谢、组织重塑和信号转导中起关键作用。Adamts2具有N端蛋白酶结构域和C端辅助结构域，辅助结构域参与底物识别和细胞表面相互作用[19]。Adamts2主要由成纤维细胞和基质细胞表达，作为一种I型前胶原N-蛋白酶，参与胶原的加工和纤维胶原的成熟。它可以特异性切割I、II、III型前胶原的N端前肽，将其转化为成熟的胶原分子。值得注意的是，TGFβ可以诱导Adamts2 mRNA和蛋白质的表达水平。Adamts2不仅与胶原纤维形成有关，还参与TGFβ信号传导过程[20]。通过调节细胞外基质的组成和结构，Adamts2影响细胞迁移、增殖和分化。在组织损伤修复和重塑过程中，Adamts2还有助于调节细胞外基质的更新和重建。先前的研究表明，Adamts2在心血管疾病、癌症和神经退行性疾病等复杂疾病中发挥作用[21]、[22]、[23]。然而，目前脊髓损伤研究领域尚未有相关报道。因此，结合单细胞测序数据分析，本文重点研究Adamts2在脊髓损伤后纤维化瘢痕形成中的作用。

在本研究中，我们使用了小鼠脊髓半切损伤模型，并结合体外TGFβ诱导的原代脊髓脑膜成纤维细胞纤维化实验来验证Adamts2调节纤维化瘢痕形成和随后轴突再生的假设。通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和qRT-PCR验证，我们发现了脊髓损伤后Adamts2的显著上调。结果表明，Adamts2通过调节Smad3信号通路在TGFβ介导的纤维化过程中起关键作用。此外，我们发现沉默Adamts2不仅抑制了促纤维化表型，还通过增强神经营养因子的分泌和激活神经元中的AKT/ERK信号通路，促进了神经支持性微环境的形成。这些发现表明，在脊髓脑膜成纤维细胞中靶向Adamts2可能是一种可行的脊髓损伤治疗方法。

部分摘录

动物

健康的雄性FVB小鼠（6–8周龄，体重18–22克），购自中国江苏省南通大学的动物实验中心（许可证编号SCXK (Su) 2023–0021和SYXK (Su) 2020–0029）。小鼠在标准条件下饲养，温度保持在18至26°C之间，湿度适宜。它们获得了充足的水和食物。所有实验操作均严格遵循相关指南进行。

脊髓损伤后成纤维细胞的表达随时间增加

为了研究SCI后不同时间点成纤维细胞（纤维化瘢痕形成的主要细胞）的变化，我们对小鼠脊髓损伤模型（0天、3天、7天、14天）的组织进行了单细胞测序分析。首先，我们对脊髓组织中的细胞进行了聚类（图1A），列出了不同细胞类型表达的代表性基因（图1B），并展示了损伤后0天、3天、7天和14天各种细胞类型的比例（图1C）。

讨论

脊髓损伤（SCI）是对中枢神经系统（CNS）的严重创伤性损伤，引发复杂的病理生理细胞和分子变化[25]、[29]、[30]、[31]。这一过程的标志是纤维化瘢痕的形成，需要将其与周围胶质瘢痕区分开来。虽然胶质瘢痕主要由反应性星形胶质细胞形成，主要在损伤周围隔离炎症，但纤维化瘢痕构成了损伤的核心。

手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，作者使用了Google Gemini辅助语言编辑和润色。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和修改，并对发表文章的内容负全责。

CRediT作者贡献声明

陈晨：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、软件使用、项目管理、方法学设计、数据管理、概念构建。薛春红：监督、软件使用、方法学设计、数据管理、概念构建。李世英：实验研究。吕叶华：项目管理、资金获取、数据管理、概念构建。刘伟：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 初稿、数据可视化、验证、监督、软件使用、概念构建。

资助

本工作得到了南通大学临床医学专项研究基金（青年项目）（资助编号：2024JQ050）、江苏省中医药协会研究项目（青年鹰计划）（资助编号：CYTF2024059）以及南通市科技计划民生项目（指导项目）（资助编号：MS2024014）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。