《Cellular Signalling》：Rap1b promotes glioma growth and stemness via regulation of Notch1 and VEGFR2 signaling pathways
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Rap1b通过调控Notch1和VEGFR2信号通路促进胶质母细胞瘤增殖、抑制凋亡并维持干细胞标志物表达，临床研究发现其高表达与肿瘤等级和生存率负相关，动物模型显示其下调可抑制肿瘤生长，提示Rap1b可作为新型治疗靶点。
Rajveer Singh Sidhu | Vanajothi Ramar | Talib Safir | Takeydra Jones | Shanchun Guo | Guangdi Wang | Mingli Liu
美国乔治亚州亚特兰大莫尔豪斯医学院微生物学、生物化学与免疫学系，720 Westview Dr SW
摘要
背景
胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的脑肿瘤，其特征是生长迅速、具有抗药性以及胶质瘤干细胞样细胞（GSCs）的富集。尽管对GBM生物学的理解有所进展，但维持肿瘤发生和干性的分子机制仍不完全清楚。
方法
我们使用患者来源的数据集、GBM细胞系、GSC培养物和异种移植小鼠模型，研究了小GTP酶Rap1b在胶质瘤进展中的作用。进行了功能测定、免疫印迹、免疫荧光、qRT-PCR和体内肿瘤生长分析。
结果
发现Rap1b在GSCs中高表达，并在调节Notch1和VEGFR2信号通路中起核心作用。功能上，Rap1b通过抑制凋亡和促进细胞周期越过G2/M检查点来促进GBM细胞的增殖和侵袭。此外，Rap1b还调节关键干性标记物CD133、ALDH1和SOX2的表达，有助于维持GSC表型。临床数据显示，Rap1b表达升高与胶质瘤患者的肿瘤级别更高和总体生存率更低相关。机制上，Rap1b在激活后转位到细胞核内，提示其可能具有转录调节器的作用。在体内实验中，Rap1b下调显著减少了裸鼠异种移植模型中的肿瘤生长。
结论
我们的发现揭示了Rap1b在通过调节Notch和VEGFR2通路促进胶质瘤细胞增殖、干性和肿瘤生长方面的先前未被充分认识的作用。这些结果表明，Rap1b可能作为胶质母细胞瘤的新治疗靶点，通过破坏维持肿瘤进展和干细胞样特征的关键信号网络发挥作用。
引言
胶质母细胞瘤（GBM）是人类最具侵袭性和恶性程度的原发性脑肿瘤，预后极差[1]，[2]。目前GBM患者的治疗标准包括手术切除，随后进行辅助放疗和口服烷化剂替莫唑胺（TMZ）[3]，[4]的化疗。尽管采取了这些治疗措施，肿瘤仍不可避免地复发、产生抗药性，并最终导致患者死亡。新兴证据表明，治疗失败部分是由于一小部分具有干性特性的胶质瘤干细胞样细胞（GSCs）所致，这些细胞驱动肿瘤复发。了解GBM异质性的细胞和分子机制至关重要，而这在很大程度上受到GSCs异质性的影响[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]。虽然单细胞转录组分析将GSCs分为四种[8]或六种亚型[5]，[6]，[12]，但它们主要对应于两种主要的分子状态：倾向神经（PN）和间充质（MES）类型。类OPC和类NPC的GSCs属于PN状态，而类MES的GSCs属于MES状态，后者是最具侵袭性和抗药性的形式。
Rap1是一种与Ras密切相关的小GTP酶，属于Ras超家族的单体GTP酶[13]。它在细胞信号传导中充当分子开关，在活性鸟苷三磷酸（GTP）结合状态和非活性鸟苷二磷酸（GDP）结合状态之间转换[14]。出乎意料的是，也在细胞核中检测到Rap1b的存在，但其在此恶性过程中的作用尚未明确[14]，[15]，[16]。Rap1在多种癌症（包括胶质瘤）的肿瘤生长和转移中起关键作用[17]，[18]。Rap1存在两种异构体Rap1a和Rap1b，它们由不同的基因编码，在DNA水平上具有95%的序列一致性[13]。这两种异构体都促进GBM细胞的增殖，尽管它们的细胞内定位和激活机制不同[19]，[20]。基因敲低研究表明，Rap1a通过激活涉及G蛋白偶联受体和RhoA的下游信号通路，在体外促进GBM细胞生长[21]。相比之下，Rap1b对于cAMP的促有丝分裂效应是必需的，cAMP在多种细胞类型中起共促有丝分裂剂的作用。此外，研究表明Rap1b在体外也促进GBM细胞的增殖[22]和迁移[23]。Rap1b表达升高会增强GBM细胞对TMZ的抗药性，而靶向Rap1b的miRNA（如miR-181[24]、miR-128和miR-149[25]）可提高TMZ的敏感性。我们之前的研究还表明Rap1b在胶质瘤细胞的增殖和侵袭中起关键作用[26]。Rap1b还通过增强整合素诱导的细胞黏附，促进Notch信号介导的造血干细胞发育[27]。此外，VEGFR2和Rap1b之间的正反馈环路已被证明可以调节内皮细胞对VEGF刺激的反应，从而促进血管生成[28]。
然而，在GBM中，Rap1b与GSCs之间的关系以及Rap1b在GSCs中的调节作用仍需进一步阐明。在这项研究中，我们旨在使用体外细胞培养模型（包括2D和3D）和体内动物模型来研究Rap1b在胶质瘤干性中的作用及其潜在的调节机制，以期将Rap1b开发为GBM患者的新治疗靶点。
抗体和试剂
Millipore公司的兔抗Notch1抗体（1:1000；目录编号07–1232）用于免疫组化（IHC），Thermo Fisher公司的鼠抗Notch 1抗体（1:1000；目录编号14–5785-8）用于Western blot。Cell Signaling Technology公司提供的兔抗Survivin抗体（1:1000；目录编号9132）、兔抗phospho-VEGFR2（pVEGFR2）抗体（1:1000；目录编号3817）和兔抗CD133抗体（1:1000；目录编号64326）。
Rap1b在GBM中高表达
此前我们报告称阳离子通道TRPM7可诱导miR-28-5p，后者靶向Rap1b，从而促进GBM细胞的增殖和侵袭[26]。为了进一步研究Rap1b在GBM肿瘤发生和干性中的作用，我们分析了GBM细胞系和GSCs中的Rap1b表达。使用HeLa细胞作为阳性对照，SVGp12（人胎儿胶质细胞系）作为阴性对照，Western blot分析显示，与SVGP12相比，GBM细胞系HTB-12、U87MG、HTB-15、HTB-138和A172中的Rap1b表达更高
讨论
在这项研究中，我们确定Rap1b是调节GBM进展的关键因子，它协调Notch1和VEGFR2信号通路，控制细胞增殖、存活和干性相关表型。通过使用多种GBM细胞系，我们证明Rap1b正向调节Notch1的激活和VEGFR2的磷酸化，从而促进细胞周期进展，抑制凋亡，并维持包括CD133、ALDH1和SOX2在内的干性相关标记物的表达。
CRediT作者贡献声明
Rajveer Singh Sidhu：验证、研究、数据分析。
Vanajothi Ramar：研究、数据分析。
Talib Safir：方法学研究、数据分析。
Takeydra Jones：方法学研究。
Shanchun Guo：研究、数据分析、资金获取。
Guangdi Wang：数据可视化、监督、研究、资金获取、数据分析、写作——审阅与编辑、初稿撰写。
出版同意
作者同意发表该研究成果。
伦理批准和参与同意
不适用。
资助
本研究得到了NIH NIGMS的SC1奖项（GM144021（ML）、少数族裔健康与健康差异（NIMHD）的U54MD007595（GW）以及NIH/NIMHD项目U54MD007602的资助。
利益冲突声明
作者声明没有潜在的利益冲突。
致谢
本研究得到了NIH NIGMS的SC1奖项GM144021（ML）、少数族裔健康与健康差异（NIMHD）的U54MD007595（GW）以及RCMI的NIH NIMHD U54MD007602项目的资助。资助机构未参与研究的设计、数据收集、分析或手稿的撰写。本研究部分得到了埃默里大学医学院资助的Emory Integrated Genomics Core（EIGC）的支持。
