《Chemico-Biological Interactions》：Tetrahydroberberine Targets the bcl-2 Promoter G-Quadruplex to Trigger Mitochondrial Apoptosis and Inhibit Nasopharyngeal Carcinoma Progression
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四氢黄连碱通过稳定bcl-2基因启动子区G4结构抑制鼻咽癌细胞增殖并激活线粒体凋亡通路，为新型G4靶向抗癌药物开发提供依据。
作者名单：龙一音、肖炳义、侯艳红、黄立端、胡向月、刘新怡、林玉勋、徐天芬、唐国胜、王玉清、蔡毅
单位：广州市和广东省分子靶点与临床药理学重点实验室、国家药品监督管理局、呼吸疾病国家重点实验室、广州医科大学药学院，中国广州511436
摘要
四氢小檗碱（THB）是小檗碱的还原衍生物，具有多种药理活性，包括心血管保护作用和神经保护效应。然而，其抗肿瘤活性及其潜在的分子机制尚未得到充分研究。B细胞淋巴瘤2（bcl-2）是一种关键的抗凋亡基因，在包括鼻咽癌（NPC）在内的多种癌症中常过度表达。在本研究中，我们探讨了THB的抗NPC作用，并通过靶向bcl-2机制阐明了其抗肿瘤机制。生物物理分析表明，THB能够以高亲和力特异性结合并稳定bcl-2启动子中的G四链结构（G4）。体外和体内实验均显示，THB以剂量依赖性方式显著抑制NPC细胞的增殖。值得注意的是，THB处理激活了线粒体凋亡途径，表现为促凋亡蛋白Bax的上调和caspase-3的切割，同时抑制了抗凋亡蛋白bcl-2的表达。这些结果表明，THB通过靶向并稳定bcl-2的G4结构以及调节Bax/bcl-2/caspase-3信号通路来诱导NPC细胞凋亡。本研究揭示了THB作为潜在的G4稳定剂在癌症治疗中的潜力，并为下一代G4靶向抗癌先导化合物的合理设计提供了理论基础。
引言
鼻咽癌（NPC）是一种起源于鼻咽黏膜的恶性上皮肿瘤，其地理分布具有显著特征，尤其在东南亚地区（尤其是中国南方）发病率较高[1]。NPC的发病机制非常复杂，由多种因素共同作用导致，包括Epstein-Barr病毒（EBV）感染、遗传易感性以及吸烟、饮食习惯和吸入性致癌物等环境因素[2]。这些相互作用因素不仅解释了NPC的地理聚集现象，还使其对现有治疗策略产生抗性。尽管放疗和同步化疗等联合治疗策略取得了进展[3]，但晚期NPC患者仍面临治疗抵抗、高转移风险和预后不良等重大挑战[4]。因此，迫切需要开发具有明确作用机制且毒性较低的新型抗癌药物，其中靶向凋亡信号通路的策略是一个有前景的方向。B细胞淋巴瘤2（bcl-2）作为一种典型的抗凋亡蛋白[5]，因在NPC及其他实体瘤中的频繁过度表达而受到广泛关注[6][7]。bcl-2的异常上调不仅与肿瘤发生和发展密切相关，还与化疗耐药性和不良临床结局密切相关[8][9][10]。临床病理学研究表明，高达97%的NPC病例中bcl-2蛋白表达阳性，且在EBV阳性肿瘤中表达率更高，这表明bcl-2过度表达是NPC的独特分子特征[11]。尽管bcl-2作为NPC治疗靶点具有巨大潜力，但目前直接抑制其BH3结合域（如venetoclax）的临床策略主要在血液系统恶性肿瘤中显示出显著疗效，而在包括NPC在内的实体瘤中的抗肿瘤活性有限，且常伴有剂量限制性的靶点毒性，如血小板减少和心脏毒性[12]。因此，开发有效的bcl-2靶向疗法需要超越传统的蛋白质水平抑制方法，转向在基因调控早期阶段（特别是转录水平）起作用的新型干预策略。
DNA G四链结构（G4s）的调节是一种创新的方法，可在上游水平调控基因转录。G4s是富含鸟嘌呤的单链DNA序列，能够自发折叠成稳定的四链二级结构[13][14]。除了在DNA损伤反应和基因组不稳定中的作用外，G4s还被认为是在肿瘤学中调控相关基因转录的关键因素，为转录控制提供了新的策略[14][16]。近年来，人们在识别靶向DNA G4s的天然产物方面取得了显著进展，多种G4结构（如myc-G4s、bcl-2-G4s和端粒G4s）已被证实为潜在的抗癌靶点[17][18][19]。最新研究表明，bcl-2基因P1启动子中的Pu39序列可形成高度稳定的G四链结构[20]，该结构在抑制bcl-2转录活性中起关键作用[21][22]。因此，选择性稳定这种启动子G4结构是一种有效的阻断bcl-2转录、诱导肿瘤细胞凋亡的方法，为抗癌药物发现提供了新方向[21][23]。事实上，多种小分子（包括天然产物及其衍生物）已被报道可通过与bcl-2 G4结构的特异性相互作用发挥抗癌作用[24]。例如，BIM-2是一种类似药物的双选择性c-MYC/bcl-2 G4配体，能够同时下调两个靶点的表达，从而诱导急性髓系白血病（AML）细胞的细胞周期停滞和凋亡[25]。Styryl quinolinium衍生物Z4表现出对c-MYC和bcl-2 G4结构的高亲和力，并在乳腺癌小鼠模型中表现出显著的肿瘤抑制作用[26]。另一项研究中发现，小分子BiGh能够以高亲和力和选择性稳定bcl-2 G4，有效抑制宫颈癌细胞的bcl-2表达并诱导凋亡[22]。此外，经典异喹啉生物碱小檗碱的衍生物具有强G4结合能力，可作为G4稳定剂发挥抗肿瘤作用，为基于天然产物的G4配体开发提供了方向[19][27]。
四氢小檗碱（THB）是从黄连（Coptis chinensis）及相关药用植物中提取的一种天然异喹啉生物碱，是小檗碱的还原衍生物[27][28][29]。与小檗碱相比，THB具有更好的稳定性、生物利用度和安全性，初步研究表明它可能具有抗肿瘤潜力[27][30]。例如，新型的四氢小檗碱-1,3,4-氧二唑杂化物已被证明是有效的多靶点抗癌剂，具有强大的基质金属蛋白酶-9（MMP-9）抑制活性[31]。尽管THB在NPC中的作用尚未明确，但其母体化合物小檗碱已被证实可通过多种信号通路抑制NPC细胞增殖并诱导凋亡。这些发现为THB可能保留甚至增强小檗碱的抗肿瘤活性提供了理论依据[32]。此外，小檗碱是一种成熟的G4结合配体。先前的研究表明，一种新型铂（II）复合物（Pt1）利用小檗碱衍生物作为配体，能够以17.9 μM的结合亲和力选择性结合bcl-2 G4，并表现出显著的抗癌活性[33]。这些观察结果表明THB也可能具有靶向bcl-2 G4结构的潜力。然而，THB是否可以直接与bcl-2启动子G4相互作用、调节其构象稳定性并进而抑制bcl-2表达以诱导NPC细胞凋亡尚不清楚。为了解决这个问题，本研究系统地探讨了THB与bcl-2启动子G4结构之间的相互作用，并在体外和体内评估了其抗肿瘤效果。同时，通过检测关键调控蛋白（包括bcl-2、Bax和caspase-3）的表达，研究了线粒体凋亡途径的参与情况。总体而言，本研究旨在提供理论和实验证据，支持THB作为有前景的G4靶向抗癌剂，并为NPC的分子靶向治疗策略提供新的机制见解。
CD谱使用Chirascan分光极谱仪（Applied Photophysics，英国）进行测定。测量范围为230至300 nm，温度为25 °C，带宽和步长均为1 nm。bcl-2 G4和双链寡核苷酸（2 μM）溶解在10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.2）中。对于热熔解测定，我们在264 nm处监测样品的椭圆率，加热过程为25至95 °C，升温速率为1 °C/min。熔解温度（Tm）通过将转变曲线拟合Boltzmann函数计算得出。
THB与bcl-2 G4及对照双链DNA的CD研究
我们利用CD谱研究了THB对bcl-2 G4构象的影响。如图1 A和B所示，添加5 μM和10 μM THB后，bcl-2 G4的CD信号没有显著变化，表明THB保持了bcl-2 G4的天然构象，并且在含有0 mM KCl/NaCl、100 mM KCl或100 mM NaCl的Tris-HCl缓冲液中具有稳定作用。
靶向DNA二级结构（尤其是G4s）已成为调控癌基因转录的创新策略[43][44]。G4结构的稳定可以抑制癌基因转录，从而发挥抗肿瘤作用[45][46]。在人类细胞中，G4s优先定位于癌相关基因的转录起始位点和转录终止位点[27]。其中，bcl-2因其关键作用而受到特别关注。
尽管传统的放射治疗和化疗等治疗方式在NPC的治疗中取得了可测量的临床疗效，但肿瘤转移、复发和治疗抵抗仍然是未解决的重大挑战[56]。因此，发现新的治疗靶点和策略具有重要的临床意义。bcl-2作为关键的抗凋亡调节因子，在多种恶性肿瘤中常过度表达，对其发挥重要作用。
侯艳红：撰写原始稿件、进行实验研究、数据管理。
肖炳义：撰写原始稿件、进行实验研究、数据管理。
龙一音：撰写原始稿件、进行实验研究、数据管理、概念构思。
蔡毅：撰写和编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。
王玉清：撰写和编辑、监督、项目管理、资金获取。
唐国胜：撰写和编辑、监督。
数据可应要求提供。
动物实验获得了广州医科大学动物伦理委员会的批准（GY-2024-001）。
所有作者声明没有利益冲突。
本研究得到了广东省自然科学基金（2025A1515012553）、广州医科大学附属中医院、广州医科大学本科生项目（02-408-2501-2375）以及中国广东省中医药局项目（20242055）的支持。
作者声明没有可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
