黑质网状部谷氨酸能神经元通过向中缝背核的投射调控雄性小鼠社会等级

本文揭示了黑质网状部（SNr）谷氨酸能（SNrGlu）神经元及其向中缝背核（DRN）的神经投射，在调控雄性小鼠社会等级中的关键作用。研究者通过光遗传学、化学遗传学及光纤光度法等方法，证实SNrGlu神经元在管测试（tube test）中的“努力行为”期（如推搡发起与回推）被特异性激活，其兴奋可提升小鼠社会等级，抑制则导致等级下降。该调控主要通过SNrGlu-DRN通路实现，该通路的活动在提升社会地位的同时还能降低焦虑水平。该研究拓展了我们对SNrGlu神经元功能的理解，为探索社会行为及焦虑等相关神经精神疾病的神经环路机制提供了新的见解。

　　

引言：社会等级与潜在神经机制

社会等级是许多动物社会（包括昆虫、鱼类、爬行动物、啮齿动物和灵长类动物）的基本组织原则。个体在等级中的位置深刻影响其健康、生存和繁殖成功率。尽管其重要性不言而喻，但支配等级建立和维持的神经机制仍未得到充分理解。此前研究表明，多个脑区与社会等级调控相关，如前额叶皮层（PFC）、杏仁核、海马、下丘脑、纹状体和外侧缰核等。其中，与奖赏和动机相关的中脑边缘多巴胺系统尤为突出，而黑质网状部（SNr）、中缝背核（DRN）和杏仁核等皮层下结构参与了一些物种的社会等级信号表征。SNr作为基底神经节的主要输出核团，整合多种上游输入信号，协调运动控制、认知、习惯形成和奖赏等多方面功能。SNr内神经元主要为γ-氨基丁酸能（GABAergic），但也包含谷氨酸能（glutamatergic）和多巴胺能神经元。相比之下，SNr谷氨酸能（SNr^Glu）神经元的作用尚不明确。DRN是中脑边缘系统的关键组成部分，是大脑中5-羟色胺（5-HT）的主要来源。大量研究表明，5-羟色胺能系统与社会奖赏及社会地位表征密切相关。值得注意的是，DRN内的5-羟色胺能神经元和GABA能神经元均接受来自SNr的谷氨酸能输入。因此，研究假设从SNr到DRN的谷氨酸能通路（SNr^Glu-DRN）可能在调控社会等级中发挥重要作用。

结果一：SNr^Glu神经元在社交竞争场景的努力行为期群体活动增强

为探究SNr^Glu神经元在管测试社交竞争中的实时群体活动，研究者向小鼠SNr双侧注射编码荧光钙指示剂GCaMP6f的病毒rAAV-CaMKIIα-GCaMP6f或对照病毒rAAV-CaMKIIα-EYFP，并植入光纤以记录钙信号。组织学分析证实，GCaMP6f或EYFP的表达主要局限于SNr，且与CaMKIIα或VGLUT2抗体共标，确认了这些神经元主要为谷氨酸能。钙信号记录显示，当表达GCaMP6f的小鼠在管中与对手发生直接对抗，在推搡发起和回推开始时，SNr^Glu神经元活动立即显著增加。相比之下，当小鼠在没有对手的情况下独自穿过管子，或EYFP表达小鼠进行管测试时，未检测到钙信号的显著变化。这些钙动力学变化表明，SNr^Glu神经元在努力行为期（如推搡发起和回推）被动态激活，其群体活动与积极的社交竞争相关。为探究SNr^Glu神经元的群体活动是否特异性地与社会等级表征相关的社交背景下的体力努力有关，研究者还进行了无社交成分的主动体力努力任务（推球测试）和非竞争性社交努力任务（社交互动测试）。结果显示，在这两种非竞争性或非社会等级相关的任务中，均未观察到与推搡相关的钙信号显著变化。这些发现共同强调了SNr^Glu神经元活动与社交竞争及社会地位之间的关系。

结果二：光遗传学激活SNr^Glu神经元足以提升管测试中的社会地位

为研究激活SNr^Glu神经元引发的行为反应，研究者向小鼠SNr双侧递送rAAV-CaMKIIα-hChR2(H134R)-EYFP（ChR2-EYFP小鼠）或对照病毒rAAV-CaMKIIα-EYFP（EYFP小鼠）。组织学分析表明，ChR2-EYFP的定位主要局限于SNr，且与谷氨酸能神经元标记物共标。随后，在注射部位上方植入光纤。病毒注射至少4周后，在小鼠进入管子前，使用473 nm蓝光脉冲刺激随机选择的单侧SNr。对单侧SNr的光刺激显著影响了小鼠在管测试中的行为表现，导致ChR2-EYFP小鼠的管测试排名上升，而EYFP小鼠未观察到此类效应。具体而言，在ChR2-EYFP小鼠中，光刺激显著增强了努力行为，包括推搡发起、回推和静止持续时间，同时减少了撤退的发生率。与对照组相比，显著提升的社会等级至少维持了4天。这些发现表明，光遗传学激活小鼠SNr^Glu神经元促进了社会等级的提升。随后的系列行为测试进一步探索了SNr^Glu神经元光遗传学激活与各种行为表现的关系。在开放场地测试中，光照射期间小鼠的运动能力显著增加，但进入中心区域的次数和在中心区域停留的时间没有显著变化，表明激活SNr^Glu神经元足以增强运动行为。在高架十字迷宫测试中，光激活本身并未影响焦虑样行为。此外，SNr光刺激小鼠在社会记忆测试中对新异小鼠表现出典型偏好，在居住者-入侵者测试中对新异小鼠表现出正常水平的攻击和非攻击行为，且激活SNr^Glu神经元不影响肌肉力量。重要的是，推球测试表明，光遗传学激活SNr^Glu神经元并未显著影响小鼠将球推出管子所需的潜伏期或主动推搡的次数。同样，社交互动测试表明，相同的激活不影响小鼠基于努力的社交行为或其非社交探索活动。这些结果表明，光遗传学激活SNr^Glu神经元不影响缺乏社交成分的主动任务中的体力努力，也不影响社交但非竞争性背景下的体力努力。

结果三：化学遗传学抑制SNr^Glu神经元导致在管测试中失败

为进一步验证SNr^Glu神经元在管测试竞争环境中的关键作用，研究者采用了抑制性DREADD系统。向小鼠SNr双侧注射rAAV-CaMKIIα-hM4D(Gi)-EGFP（hM4Di-EGFP小鼠）或对照病毒。组织学分析表明hM4Di-EGFP定位主要局限于SNr，且与谷氨酸能神经元标记物共标。随后，向实验组小鼠腹腔注射氯氮平N-氧化物（CNO，5 mg/kg），而其笼伴注射等体积生理盐水。在注射后1-1.5、3-5、6-8、24、48和72小时进行管测试。与注射CNO的EYFP小鼠相比，抑制SNr^Glu神经元导致接受CNO的hM4Di-EGFP小鼠出现显著的行为改变和管测试排名下降。在注射后3.5小时，hM4Di-EGFP小鼠的推搡发起次数和持续时间、以及静止持续时间均显著减少，而回推、抵抗和撤退的频率增加。与对照组相比显著降低的排名维持了约8小时；但在CNO给药24小时后，大多数小鼠恢复到其原始排名位置。为探究化学遗传学抑制SNr^Glu神经元引起的管测试排名变化是否能推广到其他范式评估的排名，研究者还进行了暖点测试。结果表明，抑制SNr^Glu神经元导致hM4Di-EGFP小鼠在CNO注射后2小时在暖点停留的时间显著减少。相比之下，EYFP小鼠在注射CNO或生理盐水后，暖点占据时间或社会等级均无显著变化。这些结果表明，社会等级状态可以在小鼠的不同社交环境中推广。总之，数据表明化学遗传学抑制SNr^Glu神经元导致社会支配力下降，从而强调了这些神经元在维持社会等级中的重要作用。为评估化学遗传学抑制SNr^Glu神经元后探索和运动行为的潜在变化，研究者对小鼠进行了开放场地测试。结果显示，在CNO注射后2小时，与生理盐水注射相比，hM4Di-EGFP小鼠进入中心的次数、在中心停留的时间和整体运动活动均显著减少。值得注意的是，在EYFP小鼠中，注射CNO或生理盐水后，这些运动参数未观察到显著差异。这些发现强调了SNr^Glu神经元激活在维持增强的探索和运动行为中的关键作用。为尽量减少DREADD操作可能引起的运动不协调对小鼠管测试表现的影响，研究者还在注射CNO或生理盐水2小时后使用杆测试和旋转杆测试进行了额外评估。杆测试表明，在CNO和生理盐水注射之间，或hM4Di-EGFP和EYFP小鼠之间，小鼠从头上位转为头下位所需的时间，以及从头上位下降至杆底部所需的总时间均无显著差异。同样，旋转杆测试显示，在CNO和生理盐水注射之间，以及hM4Di-EGFP和EYFP小鼠之间，潜伏期、速度和总行进距离均无显著差异。这些结果表明，DREADD介导的SNr^Glu神经元抑制并未影响小鼠的运动协调性。

结果四：SNr^Glu神经元通过SNr^Glu-DRN通路调控社会等级

接下来，研究者探究了SNr谷氨酸能神经元的具体输出通路。通过向野生型小鼠SNr注射rAAV-CaMKIIα-EYFP病毒，用EYFP选择性地标记了SNr谷氨酸能神经元及其轴突。表达EYFP的SNr谷氨酸能轴突在前脑和脑干区域被观察到，包括尾壳核（CPu）、腹后内侧丘脑核（VPM）、未定带背侧部（ZID）和DRN。为评估特异性刺激SNr谷氨酸能投射是否能调节社会等级，研究者在ChR2-EYFP小鼠中，使用管测试方案刺激了这些区域中SNr^Glu神经元的末梢。光遗传学激活SNr^Glu-CPu、-VPM和-ZID通路不影响小鼠的社会等级。然而，激活SNr^Glu-DRN通路增加了努力行为，并提升了ChR2-EYFP小鼠的社会排名，这与在SNr内光刺激SNr^Glu神经元观察到的效果一致，而在EYFP对照小鼠中未观察到类似效果。在ChR2-EYFP小鼠中，光刺激DRN内的SNr^Glu末梢显著增加了努力行为，包括推搡发起和回推，同时减少了撤退的频率。然而，这种光刺激并未显著影响静止或抵抗。值得注意的是，与对照组相比，观察到的社会地位提升至少维持了3天。这些发现表明，光遗传学激活SNr^Glu-DRN通路足以增强社会支配力。为阐明与光遗传学激活SNr^Glu-DRN通路相关的行为含义，研究者接下来进行了一系列行为测试。值得注意的是，在高架十字迷宫测试中，光激活前在开放臂停留的时间显著长于光激活期间和之后的时间。与EYFP小鼠相比，光刺激DRN中SNr^Glu神经元的末梢导致ChR2-EYFP小鼠在开放臂停留的时间增加，这表明光遗传学激活SNr^Glu-DRN通路可能调节小鼠的焦虑水平。此外，光刺激该通路在社会记忆测试中保留了对新异性的典型偏好，在居住者-入侵者测试中对新异同种表现出标准范围的攻击和非攻击行为。另外，在光照下，开放场地测试中进入中心区域的次数、在中心区域停留的时间和运动能力与无光条件相比没有显著差异。光刺激SNr^Glu-DRN通路不影响前肢肌肉力量。重要的是，推球测试表明，光遗传学激活SNr^Glu-DRN通路并未显著改变小鼠将球推出管子所需的潜伏期或主动推搡的次数。同样，社交互动测试显示，相同的激活不影响小鼠基于努力的社交行为或其非社交探索活动。因此，这些发现表明，光遗传学激活SNr^Glu-DRN通路不影响缺乏社交成分的任务中的体力努力，也不影响非竞争性社交背景下的体力努力。综上，目前的研究结果表明，SNr^Glu-DRN环路可能在调节社会等级和焦虑水平方面发挥作用，从而提示小鼠社会等级改变与焦虑之间可能存在联系。

讨论

作为基底神经节的最大输出核团，SNr整合大量上游输入信号并投射到多个脑干区域，是信号整合和协调这些靶点功能的枢纽。SNr在奖赏相关信息处理中占据战略地位，这些信息指导运动反应以确保未来奖赏。鉴于与支配等级相关的社交互动是更广泛的奖赏相关行为的一个方面，SNr神经元的活动可能与社交互动有关。与此观点一致，本研究发现激活和抑制SNr^Glu神经元对竞争结果产生相反影响。值得注意的是，SNr^Glu神经元在努力行为期间活动增强，突显了它们在介导社会等级中的关键作用。需要指出的是，SNr^Glu神经元的钙活动水平与缺乏社交成分的主动任务中的体力努力无关，也与社交但非竞争性背景下的体力努力无关。此外，光遗传学激活SNr^Glu神经元不影响独立于社交竞争的努力相关行为。这些发现进一步证实了SNr^Glu神经元在调节小鼠社会等级中的作用。因此，本研究阐明了社会支配力与SNr^Glu神经元之间的因果关系，突出了SNr在社会支配力和与社交竞争相关的努力行为中的基本作用。

当前结果表明，激活SNr^Glu-DRN通路增强了小鼠的等级支配力，这与之前强调DRN在社交互动、社交竞争、奖赏处理、认知和攻击行为中作用的研究一致。5-羟色胺能系统与多种物种（包括甲壳动物、爬行动物、啮齿动物和灵长类动物）的社会奖赏和社会地位表征密切相关。例如，将5-HT注射到龙虾和小龙虾的血淋巴中会降低撤退的可能性并延长攻击性遭遇。同样，占主导地位的雄性黑长尾猴的5-HT浓度大约是下属个体的两倍。此外，实验性增强5-羟色胺能活动有助于猴子获得支配地位，而这种活动的减少则会削弱支配地位。在人类中也记录了类似的效果，5-HT的给药会影响社会支配力。这些研究共同强调了5-羟色胺能系统在调节社会支配力和地位方面的重要性。DRN是大脑中5-HT的主要来源，其中5-羟色胺能神经元占总神经元的三分之二，并建立广泛的前脑连接。最近的研究发现，SNr为DRN内的5-羟色胺能神经元和GABA能神经元提供谷氨酸能输入。在此背景下，本研究证明SNr^Glu-DRN通路可能在调节雄性小鼠的等级支配力中发挥作用。然而，需要进一步研究以阐明与此功能相关的下游神经元具体类型和突触连接。

与之前的研究结果一致，目前的结果证明了光遗传学操作对社会等级改变的持久影响，特别是与化学遗传学激活相比。支配等级的建立可归因于一种称为“胜者效应”的强化机制，其中先前的胜利增加了未来成功的可能性，从而显著影响社会等级动态和竞争动机。由于其在毫秒级精度上激活神经元，光遗传学可能促进了胜者效应，这得到了相关神经回路内突触增强的支持。因此，光遗传学对社会等级的持久影响并非来自神经元活动的延长持续时间，而是来自其在关键行为事件中的精确时机，增强了相关神经回路内的突触可塑性。相比之下，虽然化学遗传学激活可能具有更持久的效果，但它缺乏诱导突触可塑性所需的时间特异性。需要进一步的研究来探讨与SNr相关的回路内的突触可塑性机制是否也有助于胜者效应。

等级位置显著影响生理反应、行为和精神健康，从而影响个体的整体情绪状态。具体而言，社会等级在决定对压力的易感性方面起着关键作用，并被认为是精神疾病发展的关键风险因素。在许多物种中，应激激素水平与社会等级之间存在U形关系。虽然支配个体可能享有资源的特权获取，但他们也承担着维持其地位的负担，这可能导致警惕性和压力增加。相反，从属个体通常面临与资源获取受限和社交互动有限相关的挑战，可能因不确定性或感知到的威胁而诱发焦虑。这种动态可能导致慢性社交挫败压力和相关精神疾病（如抑郁和焦虑）的风险升高。社会支配力可以通过竞争性互动获得，然而压力和焦虑都会影响社会等级的形成，突显了它们在决定动物竞争结果中的关键作用。最近在人类和啮齿动物中的研究已将特质焦虑确定为社交竞争力的关键预测因子。在人类中，较低社会地位的个体精神障碍的患病率不成比例地高，并且与较高等级的个体相比死亡率增加。在大鼠模型中，高度焦虑的个体通常会在领土竞争中输给低焦虑的同种，而低焦虑的个体在长期共居时更有可能获得支配地位。与这些观察结果一致，目前的研究结果表明，激活从SNr到DRN的谷氨酸能投射不仅增强了小鼠的社会地位，还缓解了焦虑水平。这表明低焦虑状态与获得支配力之间存在相互促进的关系。总之，这些发现突出了SNr^Glu-DRN通路作为调节雄性小鼠焦虑和社会支配力的潜在神经回路，从而为理解社会等级与焦虑水平之间的复杂关系提供了见解。然而，我们无法完全理清神经通路、社会等级和焦虑水平之间的因果关系。造成这一挑战的因素包括因果机制解释与支撑行为的神经机制之间的区别、实验设计倾向于过度简化行为复杂性，以及神经和行为数据之间的粒度不匹配。此外，我们的结果中观察到的焦虑与社会等级之间相互交织的关系使解释进一步复杂化。考虑到焦虑可能调节个体的竞争力，我们不能排除由实验操作引起的焦虑水平或其他生