《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Engineering Porous Vaterite CaCO? Nanostructures via Alcohol–Surfactant Coordination in co-precipitation: A Facile Route to Tunable Drug-Carrier Platforms
编辑推荐：
本研究采用酒精和表面活性剂辅助共沉淀法，成功制备了稳定的多孔方解石型碳酸钙纳米颗粒（约300 nm），比表面积达89.3 m2/g，抗原负载效率>99.1%，且细胞毒性低，具有显著的免疫刺激效果，为生物医学应用提供了新方法。
金承妍（Seung-Yeon Kim）|姜敏京（Min-Kyung Kang）|闵雅然（A-Ran Min）|郑真宇（Jin-Woo Jeong）|金爱真（A-Jin Kim）|朴昌洙（Chansu Park）|李康元（Kangwon Lee）|李英然（Young-Ran Lee）|金成钟（Seong-Joong Kim）
韩国陶瓷工程与技术研究院（KICET）生物融合研发部门，地址：大韩民国忠清北道清州市梧德区梧松升明1路202号
摘要
碳酸钙（CaCO?）因其优异的生物相容性、低毒性以及文石相的高比表面积和多孔性而被广泛用于药物输送领域，这些特性使得药物装载和细胞摄取更加高效。然而，文石相的不稳定性会导致其转化为稳定的方解石相，从而限制了其实际应用。本研究通过一种简便的共沉淀工艺，在醇类和表面活性剂的辅助下合成了多孔文石相CaCO?纳米颗粒，这些物质能够调节离子扩散并控制结晶路径。系统研究了醇的类型和浓度以及表面活性剂的配比对颗粒大小、形态和相组成的影响，最终获得了粒径约为300纳米、具有高比表面积（89.3 m2/g）的均匀文石相纳米颗粒。模型抗原卵白蛋白（ovalbumin）在颗粒上的吸附效率超过99.1%。此外，体外细胞毒性实验和抗原呈递实验表明该纳米颗粒具有优异的生物相容性（细胞存活率超过90%）并能够增强IL-2的分泌（约2200 pg/mL），显示出强烈的免疫刺激作用。研究结果表明，醇-表面活性剂辅助的共沉淀方法为制备稳定且多孔的文石相CaCO?纳米颗粒提供了一种简单而有效的方法。这些纳米结构在作为抗原输送载体、药物装载以及其他先进生物医学应用方面展现出巨大潜力。
引言
碳酸钙（CaCO?）是一种典型的无机材料，因其优异的生物相容性、低毒性和高溶解度而受到广泛研究[1]、[2]、[3]、[4]。它已被应用于药物输送、组织工程、环境科学和化妆品等多个领域[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。多孔CaCO?作为一种药物输送系统平台，能够有效控制药物的装载和释放速率[11]、[12]。其他代表性的无机载体，如二氧化硅、金和磷酸钙，也具有良好的生物相容性[13]、[14]、[15]、[16]、[17]，但它们存在生物降解性低、成本高以及可能在体内积累的缺点[18]、[19]、[20]。相比之下，CaCO?在生理pH值下具有成本效益且可生物降解，可通过自然分解实现药物释放[20]。
CaCO?包含三种晶体相：方解石、文石和球霰石。由于方解石和球霰石的结构稳定性较高，难以控制其溶解速率[21]、[22]，而文石相具有高比表面积和多孔结构，有助于提高药物装载效率和细胞摄取[23]、[24]。然而，在水溶液中，不稳定的文石相容易转化为热力学上更稳定的方解石相[25]、[26]。除了晶体相外，CaCO?的颗粒大小也对药物输送至关重要。大于1 μm的CaCO?颗粒在细胞内的摄取受到限制，且可能被巨噬细胞迅速清除。因此，粒径小于500纳米的纳米颗粒更适用于药物输送，因为它们的小尺寸有助于减少副作用，促进细胞摄取和快速降解[27]。因此，合成并维持文石相的CaCO?纳米颗粒对于药物输送应用至关重要。
已有多种方法可用于制备CaCO?纳米颗粒，包括乳液法、气体扩散法和共沉淀法[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。乳液法可在油水界面反应过程中形成均匀的纳米颗粒，通过添加表面活性剂和乳化剂来控制颗粒大小和分布[34]。气体扩散法通过碳酸铵的分解产生Ca2?和CO?2?，进而形成CaCO?纳米颗粒，但该方法反应时间较长、需要使用有机溶剂且能耗较高，不适合大规模生产[35]。相比之下，共沉淀法因其简单性和可扩展性而被广泛采用，但由于水基共沉淀过程的反应速率较高，难以精确控制颗粒大小和形态，通常生成的CaCO?微粒为方解石相，不适合用于药物输送。
为克服这些限制，许多研究集中在调控反应参数上，如前体浓度、反应温度、搅拌速度和添加剂[36]、[37]、[38]、[39]。Persano等人研究了前体盐浓度和反应温度对共沉淀过程中CaCO?颗粒大小的影响[37]：高盐浓度会导致颗粒快速生长和聚集，而中等盐浓度则有利于形成均匀的球形颗粒。高反应温度会增加成核频率，从而生成更小的颗粒并促进文石相的形成[37]、[40]；相反，低温则通过加速晶体生长促进大颗粒的形成[26]。Mori等人展示了在氯化钙（CaCl?）和碳酸钾（K?CO?）的水溶液混合过程中，不同的搅拌方式会影响晶体相和颗粒形状[41]。Yan等人通过改变搅拌速度来控制颗粒大小和分布[42]。Daud等人发现使用多叶轮系统进行高速搅拌能有效形成球形文石纳米颗粒[43]。添加乙二醇和甘油可以提高溶液粘度，减缓结晶过程并促进文石相的形成[44]、[45]。此外，十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）和Pluronic F127等表面活性剂可应用于乙醇-水混合物中，以控制晶体相并形成球形、花状和棒状结构[46]，但仅靠添加粘度调节剂或表面活性剂无法完全精确控制成核和生长过程，并确保颗粒的长期分散稳定性[47]。因此，还需要进一步的研究。
研究表明，溶剂混合物会影响CaCO?颗粒的晶体相和分散性[48]、[49]、[50]。Zhang等人通过减缓乙醇/水混合物中Ca2?和CO?2?离子的溶剂化速率，延迟了成核过程，从而形成了更稳定的文石相[51]。Giulia等人使用不同的醇类和盐浓度制备了文石相[52]。这些研究表明，基于醇的溶剂可以调控文石相的形成[52]。然而，目前尚缺乏减少颗粒大小和提高分散性的研究。
本研究通过共沉淀法合成了稳定的文石相CaCO?纳米颗粒，使用多种醇类作为水中的溶剂来控制颗粒大小和晶体相。基于醇的添加方式，研究了反应速率对颗粒形成的影响。此外，还向醇-水混合物中加入了Span 80和Tween 40等非离子表面活性剂以改善颗粒的分散性。这种方法既能控制颗粒大小，又能提高CaCO?的分散性。此前，Span 80和Tween 40仅用于乳液法，而在此方法中尚未报道过它们的应用。因此，这是首次探索将Span 80和Tween 40与醇类结合用于沉淀合成的研究。此外，还利用卵白蛋白（OVA）作为模型抗原评估了合成多孔CaCO?纳米颗粒的生物医学潜力。结果表明，这些纳米颗粒具有高抗原装载能力、可控的释放行为和高效的细胞相互作用，可作为具有佐剂效果的抗原输送载体，增强免疫反应而不引起显著的细胞毒性。
材料
氯化钙（CaCl?）、碳酸钠（Na?CO?）、卵白蛋白（OVA）、Tween 40（聚氧乙烯山梨醇单棕榈酸酯）、Span 80（山梨醇单油酸酯）以及甲醇、乙醇、2-丙醇、1-丁醇和1-戊醇等醇类溶剂均购自Sigma-Aldrich（美国），无需进一步纯化即可使用。采用BCA（比色蛋白测定试剂盒，Pierce?，美国）测定装载效率，使用EZ-Cytox试剂盒（DOGEN Bio，韩国）评估细胞毒性。
醇类型对CaCO?纳米颗粒形成的影响
图1展示了在不同醇类存在下合成的CaCO?颗粒的扫描电子显微镜（SEM）图像。图1(a)显示了未添加醇类制备的原始CaCO?，图1(b)–(f)分别显示了添加甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和戊醇后制备的CaCO?。在水溶液中合成的CaCO?通常形成稳定的方解石相，具有六方结构，尺寸为几微米[53]。本研究观察到了类似的趋势。
结论
本研究通过醇-表面活性剂辅助的共沉淀方法成功合成了多孔文石相CaCO?纳米颗粒。醇类和非离子表面活性剂的联合使用能够精确控制离子扩散、成核和晶体生长，从而获得平均粒径约为300纳米、比表面积高的均匀文石相纳米颗粒。系统研究表明，溶剂极性、粘度和表面活性剂的HLB值在颗粒形成过程中起着关键作用。
作者利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据可用性
数据可应要求提供。
CRediT作者贡献声明
金爱真（A-Jin Kim）：验证、方法学、数据分析。
郑真宇（Jin-Woo Jeong）：数据分析、数据管理。
闵雅然（A-Ran Min）：数据可视化、数据管理。
姜敏京（Min-Kyung Kang）：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、方法学研究。
金成钟（Seong-Joong Kim）：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、监督、概念设计。
李英然（Young-Ran Lee）：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、监督、资金获取、概念设计。
李康元（Kangwon Lee）：撰写-审稿与编辑。
致谢
本研究得到了韩国政府“传染病预防与控制技术研发计划”（项目编号：RS-2023-KH14035）、韩国陶瓷工程与技术研究院（KICET，编号：2410013749）以及韩国国家科学技术委员会（NST，项目编号：CRC22043-300）的支持。
