《Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics》：Mechanisms of heat and hypoxia defense in the sea cucumber
Apostichopus japonicus: Insights from ubiquitination regulation
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高温胁迫与低氧胁迫协同影响下，海月水母泛素化修饰及转录组学整合分析显示，联合应激组（HT_LO）中泛素结合酶mRNA表达显著上调，且鉴定出1594个赖氨酸泛素化位点，涉及膜蛋白、核糖体蛋白等通路。
作者：夏斌、宋静文、辛倩、王春雪、于婉颖、刘吉、于光明、王飞、徐东雪
单位：中国山东省青岛市青岛农业大学海洋科学与工程学院，邮编266109
摘要
海参（Apostichopus japonicus）是自然界和食品领域的重要资源。高温和缺氧是海参面临的主要压力因素。本研究显示，经过三种不同处理（高温处理、低氧处理以及高温与低氧联合处理）的海参样本中，蛋白质的泛素化水平显著升高。6种泛素化酶的mRNA表达也发生了显著变化，尤其是在高温与低氧联合处理组中。通过对泛素组学的分析，共检测到924种蛋白质上的1594个赖氨酸泛素化位点。在高温处理组、低氧处理组以及高温与低氧联合处理组中，分别有523个、387个和804个泛素化位点的表达量存在差异。在高温处理组与对照组相比，上调最多的3个差异表达基因（DUS）位于甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GADPH）、假定脂肪酸结合蛋白3型（FABP3）和热休克蛋白90-α（HSP90α）中。部分上调基因在高温处理组与对照组以及低氧处理组与对照组之间的表达也存在差异，例如FABP3中的K(101)和HSP90α中的K(104)。与对照组相比，高温与低氧联合处理组中profilin（PFN）、分子与CasL 3相互作用蛋白（MICAL3）、细胞色素P450（CYP450）和HSP90α的泛素化水平显著升高。与膜蛋白和核糖体蛋白相关的GO通路，以及涉及细胞降解和核糖体的KEGG通路，在所有处理组中均显著富集。值得注意的是，mTOR信号通路、FoxO信号通路和TGF-β信号通路仅在高温与低氧联合处理组中显著富集。通过整合泛素组学和转录组学数据，发现了在泛素化和mRNA水平上都发生失调的多种基因。我们的研究有助于从蛋白质泛素化的角度进一步揭示海参的应激响应机制。
引言
海参资源分布于全球各大海洋（Xu等人，2015年）。在40多种可食用的海参物种中，部分物种已成功实现商业化养殖，以满足日益增长的消费需求，例如温带物种Apostichopus japonicus和热带物种Holothuria scabra（Hamel和Mercier，2008年）。2024年，中国海参的养殖面积达到268,467公顷，产量达到326,172吨（农业农村部，2025年）。尤其是Apostichopus japonicus作为亚洲地区的热门奢侈品，在海鲜市场中占据重要地位，并推动了水产养殖业的繁荣（Purcell等人，2012年；Yang和Bai，2015年）。
尽管养殖规模庞大且产量可观，但Apostichopus japonicus的水产养殖业仍面临诸多挑战，其中夏季的高死亡率是一个突出问题（Ru等人，2019年）。该物种的适宜生长温度为10至20°C，超过30°C的温度通常对其生存构成威胁（Xu等人，2023年）。受全球气候变化影响，Apostichopus japonicus的主要养殖区——黄海和渤海沿岸地区频繁出现极端高温现象（Huo等人，2019年）。低溶解氧也是影响水产动物生长、繁殖甚至存活的主要压力因素（Wu，2009年；Huo等人，2018年；Zheng等人，2022年）。夏季低溶解氧与高温常常同时发生，这种复合压力对包括海参在内的水生生物造成严重影响（Beemelmanns等人，2021年；Zanuzzo等人，2022年；Huo等人，2022年）。为提高Apostichopus japonicus的抗逆能力，人们已采取了一些措施，如温度适应性和选择性育种（Meng等人，2009年；Dong等人，2010年；Wang等人，2013年；Wang等人，2015年）。了解该物种的应激响应分子机制有望为其抗逆能力的提升提供新的途径。
泛素是一种高度保守的蛋白质，由76个氨基酸残基组成，可通过异肽键与其他蛋白质结合（Hanna等人，2007年）。蛋白质泛素化是一种关键的翻译后修饰，参与多种真核生物生物学过程，如代谢、转录、翻译、囊泡运输和细胞凋亡（Hershko和Ciechanover，1998年；Komander和Rape，2012年；Swatek和Komander，2016年）。在高温和缺氧等环境压力下，蛋白质错误折叠是细胞面临的最大威胁（Vabulas等人，2010年）。蛋白质的重折叠和降解是防止受损蛋白质积累的两种机制（Tyedmers等人，2010年）。前者主要依靠多种伴侣蛋白的辅助，而在蛋白酶体降解途径中，泛素分子与目标蛋白质的结合是关键信号（Franzmann和Alberti，2021年）。早期研究表明，43°C的高温会引发哺乳动物细胞中的泛素化反应和蛋白质降解（Parag等人，1987年）。越来越多的证据表明，泛素通路在应激响应中起着重要作用（Belknap和Garbarino，1996年；Maxwell等人，2021年）。在热应激和缺氧条件下，多种与泛素相关的基因（如E3泛素蛋白连接酶topors-like）的表达会上调（Gleason和Burton，2015年）。然而，Apostichopus japonicus在热应激和缺氧条件下的泛素化机制尚不完全清楚。
本研究检测了三种不同处理组（高温处理、低氧处理以及高温与低氧联合处理）和对照组中蛋白质的泛素化水平以及泛素化酶的mRNA表达情况。采用无标记定量方法（LFQ）和液相色谱-串联质谱分析（LC-MS/MS）技术对泛素化情况进行分析，量化了赖氨酸泛素化位点（Kub），并分析了差异表达的位点。通过整合泛素组学和转录组学数据，揭示了在泛素化和mRNA水平上都发生失调的基因。针对特定泛素化位点进行了平行反应监测（PRM）分析，以验证泛素组学数据的可靠性。我们的研究有助于从蛋白质泛素化的角度进一步揭示海参的应激响应机制。
样本
2023年7月，从中国山东省莱州市的一个水产养殖场采集了重量在100克至110克之间的Apostichopus japonicus海参。这些海参被转移到我们的实验室后，在17°C、30‰盐度和7±0.5 mg/L溶解氧的环境中适应了2周。适应期间，海参被提供过量饲料，每天及时清除剩余饲料和粪便（Xia等人，2017年；Ju等人，2024年；Zhao等人，2026年）。
泛素化水平及泛素化酶的mRNA表达
我们的Western blot分析证实，来自对照组（C）、高温处理组（HT）、低氧处理组（LO）以及高温与低氧联合处理组（HT_LO）的肠道组织匀浆中的多种蛋白质均可被泛素标记（图1a）。观察发现，这三个处理组的蛋白质泛素化水平均高于对照组。
通过RT-qPCR技术检测了部分泛素化酶的mRNA表达情况。
泛素化模式对海参生物功能和应激响应的影响
泛素最初被认为是26S蛋白酶体降解受损和错误折叠蛋白质的信号分子，后来发现它还参与调控蛋白质的定位、运输和信号复合体或调控复合体的识别（Hanna等人，2007年；Foot等人，2017年）。许多细胞过程都受到泛素化的影响，范围从细胞信号传导到蛋白质稳态（Pasten等人，2012年）。多种酶参与了泛素化过程。
结论
高温和缺氧是Apostichopus japonicus面临的主要压力因素。本研究显示，这些压力因素显著影响了蛋白质的泛素化水平及泛素化酶的mRNA表达，尤其是在高温与低氧联合处理条件下。泛素组学分析共检测到924种蛋白质上的1594个赖氨酸泛素化位点。在三种处理组中，一些关键差异表达基因（DUS）被重点关注，包括膜蛋白和核糖体蛋白中的位点。
作者贡献声明
夏斌：研究指导。
宋静文：初稿撰写。
辛倩：方法学设计。
王春雪：数据整理。
于婉颖：数据验证。
刘吉：初稿撰写、审阅与编辑。
于光明：数据整理。
王飞：数据整理。
徐东雪：初稿撰写、资金申请及概念框架制定。
未引用参考文献
Zanuzzo, Beemelmanns, Hall, Rise和Gamperl, 2020
Zhu等人, 2020
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：32473186、42276143、32273159）、山东省自然科学基金（项目编号：ZR2022MC050）、山东省现代农业产业体系（项目编号：SDAIT-22-02）以及山东省一级渔业学科项目的资助。
