基于计算预测和分子模拟开发的一种多表位mRNA疫苗，该疫苗针对阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）的囊泡多糖蛋白

《Computational Biology and Chemistry》：Computational Prediction and Molecular Simulation-Based Development of a Multi-Epitope mRNA Vaccine Targeting Capsule Polysaccharide Proteins of Enterobacter cloacae

肠杆菌肠氏菌多糖抗原mRNA疫苗开发及免疫原性评估。本研究基于肠杆菌肠氏菌5种多糖相关蛋白，运用免疫信息学技术筛选出12个HLA-I/II、Toll样受体-2/4结合的B/T细胞表位，构建含佐剂的复合疫苗，通过分子对接和动态模拟验证其稳定性，经密码子优化后评估疫苗免疫原性，为新型疫苗开发提供理论依据。

　　

Shubhi Singh | Priya Swaminathan

生物技术系，生物工程学院，工程与技术学院，SRM科学技术学院，Kattankulathur，Chengalpattu，泰米尔纳德邦，印度，603203

摘要

Enterobacter cloacae（EC）是一种常见的新兴病原体，与多种感染有关，包括肺部感染、败血症、尿路感染、手术部位感染以及新生儿重症监护病房中的疫情。因此，开发针对Enterobacter cloacae的创新疫苗至关重要。本研究重点关注Enterobacter cloacae的五种荚膜多糖（CPS）蛋白，以识别潜在的表位，从而开发出用于预防该病原体引起的感染的mRNA疫苗。在疫苗开发过程中采用了多种免疫信息学技术来诱导细胞和体液反应。最终，我们评估并确定了12个HTL、CTL和LBL表位，并将它们与佐剂结合制备成三种不同的疫苗。通过分子对接分析预测了所选表位与其相应MHC等位基因之间的相互作用。随后，利用分子动力学模拟预测了结合复合物的稳定性，并通过计算机模拟进行了免疫学测试。为了在人体内有效生成mRNA，还进行了密码子优化。所提出的疫苗构建体似乎是应对Enterobacter cloacae感染的有希望的候选者，适合进行体外研究以确认其有效性。

引言

抗菌素耐药性日益被视为对健康的全球性威胁，导致更高的死亡率和发病率，并造成巨大的经济损失。抗菌素耐药性（AMR）的根本原因是抗生素在医学、农业、人类、动物和整个环境中的滥用（Rapin等人，2010年）。细菌感染迅速削弱了身体的先天防御系统，限制了急性感染的治疗选择。免疫治疗剂（针对病原体的抗体）和免疫疗法可以用于应对细菌感染（Evan Reddick和Alto，2014年）。可以利用治疗性单克隆或多克隆抗体开发针对病原体的疫苗，以保护易感人群或治疗过敏性呼吸系统疾病。目前尚无获批的疫苗可用于治疗这些院内感染；然而，它们的使用可以显著减轻医院的疾病负担（Gagneux-Brunon等人，2018年）。

在基因组时代之前，疫苗的发现基于巴斯德的疫苗学原理（Rappuoli，2004年）。Salk和Sabin利用这些原理开发出了针对脊髓灰质炎的有效疫苗（Alghamdi，2021年），这些原理的应用还包括针对腮腺炎、麻疹、风疹以及针对结核分枝杆菌的卡介苗（BCG）（Di Pietrantonj等人，2020年）。然而，传统的巴斯德疫苗学对于无法在体外培养的微生物存在局限性，主要是由于不适当的培养条件或安全问题（Bambini和Rappuoli，2009年）。基于培养的疫苗的广泛应用受到广泛的抗原决定因素和分子模拟问题的严重阻碍（Bidmos等人，2018年）。这些差异促使人们转向开发针对细胞成分的亚单位疫苗候选者，这些成分被认为是毒力因子。然而，这类疫苗的设计成本高昂、耗时且劳动密集，因为在大量特定细菌病原体中找到符合疫苗标准的目标的概率非常低（Bidmos等人，2018年）。为了加快疫苗前开发阶段的速度，人们研究了高通量和创新替代方法，这对于控制快速传播的细菌疾病尤为重要（Ghaemmaghamian等人，2022年）。基因组时代的到来标志着疫苗学领域的革命。现在，通过鸟枪法测序和生物信息学方法获得的病原体完整基因组序列，正在识别潜在的表面相关抗原用于疫苗生产（Ismail等人，2020年）。反向疫苗学（RV）是一种新技术，它利用遗传数据识别表面暴露的蛋白质作为合适的疫苗靶点，无需培养微生物。RV已成功用于开发针对B群脑膜炎球菌（4CMenB）的多组分疫苗（Marshall等人，2023年）。

Enterobacter cloacae是呼吸道和尿路感染的主要原因。它是美国第二常见的碳青霉烯类耐药Enterobacteriaceae（CRE），并且越来越多地与碳青霉烯类耐药感染的增加有关（Ioannou等人，2022年）。这种厌氧革兰氏阴性细菌与新生儿疾病、发病率和多重耐药性有关。E. cloacae已成为最常见的院内病原体之一，影响有基础疾病、免疫抑制和长期住院的患者，尤其是在重症监护病房和烧伤病房。它通常导致败血症、尿道炎和下呼吸道感染，尽管化脓性关节炎较为罕见（Zong，X.，2021年）。近年来，开展了大量研究以开发针对不同类型细菌的有效疫苗。许多研究集中在Vibrio harveyi的整个蛋白质组上选择抗原（Islam等人，2022年），而其他研究则探讨了Acinetobacter baumannii中的AmpD、OmpA、BauA、Omp34和OmpK（Xu等人，2024年）。

据信，激活免疫反应的细菌外膜的三个主要成分是蛋白聚糖、脂多糖蛋白和外膜蛋白（Matsuura，2013年）。这层外膜保护细菌免受噬菌体、干燥和原生动物捕食的侵害，并能阻碍吞噬作用。荚膜多糖是关键的毒力决定因素，它们通过抑制补体激活和吞噬作用使细菌病原体能够逃避宿主免疫反应。参与荚膜生物合成、运输和调节的蛋白质在功能上至关重要，在不同菌株之间具有保守性，且比多糖本身更不易发生抗原变异（Zierke等人，2025年）。它们的表面相关或周质定位进一步增强了免疫识别，使荚膜多糖相关蛋白成为疫苗开发的理想靶点。因此，荚膜多糖（CPS）被视为针对Klebsiella的治疗干预的有希望的目标（Kim等人，2002年）。有报道称，通过Wzx/Wzy依赖途径生产CPS或K-抗原可以增强CPS的表面表达，可能成为疫苗或药物的有效靶点（Sachdeva等人，2017年）。迄今为止，尚未有研究从Enterobacter cloacae的CPS蛋白中鉴定出可能的疫苗候选表位。

在这项研究中，我们构建了一种针对荚膜多糖（CPS）蛋白的mRNA疫苗，因为CPS参与了细菌的生物膜形成，并增强了细菌的存活能力和对抗生素的耐药性。然而，合成肽和DNA疫苗的免疫原性通常有限，而且DNA疫苗可能导致突变。幸运的是，这些挑战可以通过大规模快速高效地生产mRNA疫苗来克服。我们的主要目标是设计针对Enterobacter cloacae

部分摘录

蛋白质序列的检索和筛选

从UniProt数据库（https://uniprot.org）获取了Enterobacter cloacae的多糖输出蛋白Wza（A0A2T4XWD9）、荚膜生物合成蛋白（A0A7H8UAP6）、低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶Wzb（A0AAQ0Y3I6）、酪氨酸蛋白激酶Wzc（A0A4Q2E3U1）和含O-抗原连接域蛋白（A0A2T4Y6G9）的序列，并下载了dFASTA序列以供后续分析。

潜在疫苗候选物的鉴定

Vaxi-DL（https://vac.kamalrawal.in/vaxidl/）是一个基于网络的工具

细胞毒性T淋巴细胞表位预测

细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）与主要组织相容性复合体（MHC）分子结合，以识别抗原呈递细胞（APCs）（Nakayama，2015年）。CTLs是重要的白细胞，在免疫反应中起关键作用，分泌多种细胞因子，并与自然杀伤细胞合作消除癌细胞、病毒和其他抗原实体（Xu等人，2024年）。

NetCTL 1.2服务器（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetCTL-1.2/）和IEDB平台（//tools.immuneepitope.org/

蛋白质序列检索

为了预测B细胞和T细胞表位，从UniProt中检索了Enterobacter cloacae的荚膜多糖蛋白。使用这些表位创建了多表位mRNA疫苗，具体细节见表1。

潜在疫苗候选物的鉴定

使用Vaxi-DL评估了所选的五种蛋白质作为潜在的疫苗候选物。在这5种蛋白质中，有2种不是疫苗候选物，即荚膜生物合成蛋白和低分子量蛋白-酪氨酸磷酸酶Wzb。

讨论

Enterobacter cloacae是动物肠道菌群中普遍存在的细菌，已知会导致尿路感染（UTIs）、呼吸道感染（包括肺炎）、伤口和手术部位感染、菌血症和败血症、骨髓炎、心内膜炎、腹腔感染，尤其是在免疫功能低下的人群中。因此，这些疾病的发病率较高，导致人们对这种细菌的共生形式关注不足，尤其是在其在维持宿主健康方面的作用方面。

结论

Enterobacter cloacae由于耐药菌株的增加和易感人群的增长，对全球公共卫生构成了重大威胁。本研究利用免疫信息学方法开发了一种多表位mRNA疫苗，该疫苗具有强免疫原性、无毒性、非敏感性和抗原性。该疫苗的稳定疫苗-受体复合物对先天免疫受体具有很强的亲和力，可以诱导免疫反应。

缩写

EC – Enterobacter cloacae CPS – 胶囊多糖 AR – 抗菌素耐药性 BCG – 卡介苗 CRE – 碳青霉烯类耐药肠杆菌科 APCs – 抗原呈递细胞 MHC – 主要组织相容性复合体 CTLs – 细胞毒性淋巴细胞 HTLs – 辅助T淋巴细胞 IEDB – 免疫表位数据库 LBL – 线性B细胞 HLA – 人类白细胞抗原 CTB – 霍乱毒素B TIP3P – 可转移分子间势能3P MD – 分子动力学 JCat – Java密码子适配工具

资金来源

本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。

未引用的参考文献

(Ahmad等人，2019年；Alghamdi，2021年；Dhople等人，2006年；Ismail等人，2020年；Kim等人，2011年；Rawal等人，2022年；Saadi等人，2017年；Sanami等人，2020年；通过干燥稳定疫苗：设计考虑的质量，2022年；ul Qamar等人，2021年；Vaxi-DL，2022年；Zong等人，2021年)

CRediT作者贡献声明

Priya Swaminathan：监督、软件、资源、项目管理、研究构思。 Shubhi Singh：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们要感谢SRM HPCC提供计算设施，以及该机构为我们提供进行研究的机会。同时感谢SRMIST生物工程学院的支持。

利益冲突

作者声明不存在财务利益冲突。