中国绒螯蟹（Eriocheir sinensis）细胞增殖过程中CDK基因家族的鉴定与功能研究

《Fish & Shellfish Immunology》：Identification and Functional Study of CDK Gene Family in Cell Proliferation in the Chinese Mitten Crab ( Eriocheir sinensis)

中国绒螯蟹CDK基因家族系统分析揭示其在细菌刺激诱导的细胞增殖调控中起关键作用，鉴定到19个CDK基因并证实CDK2-L1和CDK4通过与Cyclin E/A/D形成功能复合物驱动增殖。

　　

张文|王子峰|徐超辉|沈国清|朱耀廷|李伟伟|王群|范新鹏

华东师范大学生命科学学院，中国上海200241

摘要

CDK基因在细胞周期进展和转录调控等关键生物过程中起着至关重要的作用。然而，中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）中CDK基因家族成员的具体数量一直不清楚。在这项研究中，我们通过全基因组分析鉴定了E. sinensis中的19个CDK基因。系统发育分析将它们分为13个主要亚家族，所有亚家族都包含一个相对保守的S_TKc结构域。这19个基因中的大多数在表皮和肌肉组织中表现出高表达水平。此外，其中6个基因在细菌刺激下显著上调。由于细菌刺激可以促进细胞增殖，我们敲低了高表达的CDK基因，发现CDK2-L1或CDK4的缺失会消除促增殖表型，表明它们在调节细胞增殖中起着重要作用。此外，我们还证明了CDK2-L1与CyclinE和Cyclin A相互作用，而CDK4与Cyclin D结合——这两种周期蛋白都是细胞增殖的关键调节因子。因此，这项研究表明CDK2-L1和CDK4通过与各自的周期蛋白伴侣形成功能性复合物来调节细胞增殖。

引言

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是中国重要的水产养殖物种，主要分布在渤海和黄海等沿海地区[1]。随着全球对高质量水产品需求的增长，其经济价值持续上升[2]。然而，在养殖过程中，E. sinensis受到各种病原体的威胁。有效减少疾病的发生和抗生素的使用——从而提高经济价值水产品的质量并降低生产成本——已成为亟待解决的问题[3]，[4]。尽管无脊椎动物缺乏脊椎动物所具有的适应性免疫系统，但它们的免疫反应仍然严重依赖于细胞增殖[5]，尤其是在细胞免疫和体液免疫的放大阶段[6]。细胞增殖是生物体的基本特征，细胞通过分裂来增殖[7]。这一过程支撑着生物体的生长、发育、繁殖和遗传延续。为了确保这一过程准确无误地进行，细胞进化出了一套复杂的调节机制[8]。细胞周期的调节主要依赖于三类主要的调节因子：周期蛋白依赖性激酶（CDKs）、周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CKIs）[9]。研究参与细胞增殖的分子将有助于更深入地理解其机制，并为E.sinensis的生长和存活模式提供更清晰的见解。

CDKs（周期蛋白依赖性激酶）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它们对应并驱动细胞周期的进展[10]，[11]。通过磷酸化目标蛋白上的特定丝氨酸和苏氨酸残基，CDKs促进细胞周期的推进[12]。不同的CDKs在细胞周期中依次被激活，并与周期蛋白共同作用，形成异二聚体复合物[13]。在这些复合物中，CDK作为催化亚基，而周期蛋白作为调节亚基。它们共同协调细胞周期各阶段的有序过渡，使CDKs成为细胞周期控制的核心调节因子[14]，[15]，[16]。迄今为止，已经鉴定了20种不同的CDKs[17]。不同的CDKs通过与相应的周期蛋白结合来发挥作用。先前的研究表明，细菌刺激可以促进E.sinensis中的血细胞增殖，而在细菌刺激后添加白细胞介素-16可以显著增强血细胞增殖率[5]。然而，E.sinensis中的细胞增殖机制以及与细胞增殖相关的CDK基因的存在和基本特征仍然不清楚，需要进一步研究。

在这项研究中，我们鉴定了E.sinensis中的CDK基因家族。共鉴定出19个CDK基因，根据系统发育分析将其分为13个主要亚组。这些基因具有相对保守的丝氨酸/苏氨酸激酶（S_TKc）结构域[18]，分布在16条不同的染色体上。在细菌刺激后，包括CDK2-L1、CDK3、CDK4、CDK5-L1、CDK5-L2和CDK-Like在内的多个基因在刺激后24小时表现出显著上调。敲低显著上调的基因CDK2-L1和CDK4会导致细胞增殖受到抑制。此外，预测分析表明，与先前的报告一致，鉴定的CDK基因可能与Cyclin蛋白相互作用，形成功能性复合物，从而共同调节细胞增殖。

实验部分

动物与血细胞培养

实验用的E.sinensis（100 ± 10克）购自中国上海崇明曙光水产养殖场。为了减少实验误差，选择了附肢完整、状态良好且大小几乎相同的成年E.sinensis用于研究。实验前一周，将这些螃蟹转移到实验环境中进行适应。饲养条件保持最佳：淡水预先充氧以确保充足的氧气供应，水温为

CDK的鉴定和序列分析

序列鉴定和分析确认所有19个基因都能成功扩增，因此被鉴定为非假基因。相应蛋白质的理化特性总结在表2中。分子量范围从12.78 kDa到120.48 kDa，理论等电点（pI）介于5.07到9.72之间。

基序分析和染色体定位

使用MEME工具包进行基序预测和分析，站点分布模型设置为“零次或一次出现”

讨论

虽然CDK基因的功能已在多种植物和动物物种中得到了广泛研究[30]，[31]，但对E.sinensis中CDK基因家族成员的系统分析仍不清楚，这限制了对其独特生理调节机制的理解。在这项研究中，我们鉴定了E.sinensis中的19个CDK基因，并系统阐明了该基因家族在细胞增殖中的作用。实验证据表明，细菌感染显著

作者声明

张文：概念提出、研究设计、方法论、数据分析、原始稿撰写、软件使用、数据管理。

王子峰：研究实施。

徐超辉：研究实施。

沈国清：方法论设计。

朱耀廷：方法论设计。

李伟伟：资金获取、实验监督。

王群：资金获取、实验监督。

范新鹏：实验监督。

利益冲突声明

作者声明他们与本工作没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢华东师范大学分子动物学实验平台（中国上海）和上海海洋大学无脊椎动物细胞免疫学实验室（中国上海）提供了进行这项研究所需的仪器。