嗜水气单胞菌通过其分泌的效应蛋白，在草鱼（Ctenopharyngodon idella）的脾脏巨噬细胞中诱导线粒体自噬，从而实现细胞内的存活

《Fish & Shellfish Immunology》：Aeromonas hydrophila induces mitophagy for intracellular survival through its secreted effectors in the splenic macrophages of grass carp ( Ctenopharyngodon idella)

本研究探讨弧菌通过诱导巨噬细胞线粒体自噬增强其胞内生存机制。发现弧菌感染导致线粒体膜电位下降、ATP减少及ROS升高，并通过PINK1/Parkin通路激活自噬，共定位增强及融合促进。自噬抑制剂Mdivi-1逆转效应，而自噬诱导剂CCCP增强细菌存活，表明弧菌利用宿主自噬机制规避免疫。为胞外病原体存活机制研究提供新思路。

　　

马晓宇|叶荣|李万松|欧振宏|周洪

中国电子科技大学生命科学技术学院，成都，中华人民共和国

摘要

嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是一种广泛分布于水生环境中的革兰氏阴性细菌，对水生动物构成了主要的病原威胁。本研究探讨了嗜水气单胞菌如何通过诱导线粒体自噬来促进其在草鱼（Ctenopharyngodon idella）脾脏巨噬细胞中的生存。研究结果表明，嗜水气单胞菌通过降低线粒体膜电位和ATP水平以及增加线粒体ROS（mtROS）的产生，破坏了线粒体的完整性。同时，该细菌减少了线粒体外膜蛋白TOM20的表达，伴随着自噬标志物LC3与TOM20的共定位增加，以及线粒体与溶酶体的融合增强。这些效应可以通过线粒体自噬抑制剂Mdivi-1得到逆转，从而证实了嗜水气单胞菌诱导的线粒体自噬的发生。随后，我们发现活细菌及其培养上清液能够触发线粒体自噬反应，而热灭活的上清液则不能。通过PINK1-Parkin通路验证嗜水气单胞菌诱导线粒体自噬的机制包括PINK1/Parkin表达的上调，以及Oroxylin A对TOM20-LC3共定位的阻断（Oroxylin A能够特异性抑制PINK1-Parkin通路）。此外，在脾脏巨噬细胞中，嗜水气单胞菌诱导的线粒体自噬具有重要的生理意义，因为预先使用Mdivi-1处理可以显著减少细胞内的嗜水气单胞菌负荷。相反，线粒体自噬诱导剂m-氯苯腙（CCCP）反而增强了细菌的生存能力，表明嗜水气单胞菌通过触发线粒体自噬来维持其细胞内生存。总体而言，嗜水气单胞菌通过分泌效应因子诱导PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，从而减轻了抗菌压力并促进了自身的生存。这为理解细胞外病原体的细胞内生存机制提供了新的视角。

引言

嗜水气单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，广泛存在于水生生态系统中，包括河流、淡水流域的沿海地区和自来水中[1]，导致严重的经济损失，尤其是在草鱼（Ctenopharyngodon idella）中[2]。这种细菌的致病性归因于其多种毒力因子，包括从其分泌系统释放的效应因子（如溶血素、气溶素）[3]和外膜囊泡（OMVs）[4]。这些成分共同使嗜水气单胞菌能够破坏宿主的免疫防御[5]。

为了自身的生存，嗜水气单胞菌利用多种策略来操控宿主细胞的死亡。例如，嗜水气单胞菌可以诱导免疫细胞发生凋亡[6]、焦亡[7]和铁死亡[8]，从而导致组织损伤和系统性的传播。在这些细胞死亡过程中，细菌可能会攻击并破坏线粒体的功能，线粒体是负责能量产生和死亡信号传导的关键细胞器[9]。对于嗜水气单胞菌来说，它通过损害线粒体功能来启动凋亡级联反应，并通过释放细胞毒性肠毒素来触发凋亡[10]、[11]。最近的研究表明，嗜水气单胞菌会导致严重的线粒体功能障碍，进而导致脂质活性氧（ROS）的积累并破坏铁稳态，从而驱动细胞走向铁死亡[8]、[12]。事实上，这种依赖铁的细胞死亡形式以脂质过氧化和谷胱甘肽耗竭为特征，会损害组织完整性并加剧嗜水气单胞菌引起的感染[8]、[12]。

值得注意的是，宿主对线粒体损伤的反应不仅包括释放死亡信号，还包括启动质量控制机制，其中最主要的是线粒体自噬，这是一种选择性的自噬形式，能够降解受损的线粒体以维持细胞稳态[13]、[14]。实际上，线粒体自噬在宿主-病原体相互作用中具有情境依赖性和双重作用。一方面，它通过清除受损的线粒体来保护宿主，从而限制过度炎症并维持细胞稳态[15]；另一方面，越来越多的证据表明，细胞内病原体已经进化出利用线粒体自噬来谋取自身利益的策略。例如，单核细胞增生李斯特菌 [16]、金黄色葡萄球菌 [17]和牛分枝杆菌 [18]通过操控线粒体自噬来逃避免疫监视，要么将其作为生存空间，要么减弱抗菌反应。相比之下，细胞外病原体操控线粒体自噬的机制尚不明确。先前的研究表明，细胞外细菌可以通过分泌的毒力因子间接调节线粒体功能[19]、[20]，但尚不清楚这些细菌是否真的能诱导线粒体自噬。对于嗜水气单胞菌来说，已有报道指出它会导致线粒体损伤[21]，但这种病原体是否具体利用宿主的线粒体自噬机制作为细胞内生存策略仍是一个关键且未解决的问题。

因此，本研究旨在探讨嗜水气单胞菌是否在鱼细胞中诱导线粒体自噬，并评估线粒体自噬在嗜水气单胞菌与鱼宿主之间的相互作用中的作用。在此研究中，我们检测了嗜水气单胞菌
感染对草鱼脾脏巨噬细胞线粒体功能障碍的影响，包括膜电位的丧失、ATP的耗竭和ROS的产生。为了探索细菌感染后线粒体自噬的可能机制，我们研究了该细菌对线粒体标记物TOM20的降解、TOM20与自噬体标记物LC3-II的共定位、线粒体与溶酶体的融合以及PINK1-Parkin通路（经典的泛素依赖性线粒体自噬途径）的参与情况。此外，还评估了线粒体自噬在细菌在脾脏巨噬细胞中生存中的作用。我们的发现揭示了嗜水气单胞菌的一种新的细胞内生存策略，即它通过分泌效应因子利用宿主的PINK1-Parkin介导的线粒体自噬来减轻抗菌压力，为理解细胞外病原体的细胞内生存机制提供了新的视角。

实验部分

实验动物

健康的草鱼（体重约1公斤）购自中国成都的通威水产科技有限公司。在正式实验前，这些草鱼在实验室循环水系统中适应了两周，并每天喂食商业饲料。文中描述的所有动物实验均获得了中国电子科技大学伦理委员会的批准（批准编号：1061424022728074）。

细胞分离与培养

草鱼脾脏细胞

嗜水气单胞菌感染导致草鱼脾脏巨噬细胞线粒体功能障碍

为了确定嗜水气单胞菌是否破坏线粒体稳态，我们首先检测了关键的线粒体功能指标。结果显示，嗜水气单胞菌
感染导致线粒体膜电位（Δψm）显著下降，这种下降与感染剂量（MOI）相关（图1A）。相应地，在MOI 1-10的情况下，细胞内ATP的产生显著减少（图1B），表明线粒体功能受到明显影响

讨论

嗜水气单胞菌被经典定义为一种细胞外病原体[23]，具有深刻重塑细胞内细胞器稳态的能力。通常，细胞外病原体主要依靠细胞外环境或短暂相互作用来对宿主施加毒性，而细胞内病原体则通过内化的方式附着并侵入宿主细胞[21]。与细胞内病原体（如单核细胞增生李斯特菌、牛分枝杆菌）不同

数据获取

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明本研究未涉及任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。

作者贡献

马晓宇：撰写原始稿件、方法设计、实验实施、数据分析、验证、数据管理。叶荣、李万松和欧振宏：实验实施、方法设计。周洪：撰写修订稿件、监督、资金获取、概念构思。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：32473205）的支持。