《Fish & Shellfish Immunology》：CcFTR54 restricts spring viremia of carp virus replication by promoting p62-mediated autophagic degradation of N protein
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本研究发现common carp的FTR54蛋白通过E3泛素连接酶作用，以K48连接方式修饰SVCV的N蛋白，增强p62介导的靶向自噬降解，从而干扰素非依赖性抑制病毒复制，揭示了鱼类TRIM蛋白介导的病毒清除新机制。
刘荣荣|高宏霞|李欣|杨桂文|李华|单世娟
山东省动物抗性生物学重点实验室，山东师范大学生命科学学院，中国济南文华东路88号，250014
摘要
三联基序（TRIM）蛋白家族是E3泛素连接酶中最大的一个家族，在宿主的抗病毒先天免疫中起着关键作用。在真骨鱼类中，鳍TRIM蛋白（FTR）经历了谱系特异性的扩张。然而，大多数FTR成员的抗病毒功能和分子机制仍很大程度上尚未被探索。在这项研究中，我们从普通鲤鱼中鉴定出一种新的FTR蛋白（命名为FTR54），并证明了其在抵抗鲤鱼病毒（SVCV）引起的春季病毒血症中的关键抗病毒作用。研究发现，在SVCV感染后，CcFTR54在免疫相关组织和外周血白细胞（PBLs）中的表达显著上调。功能分析显示，CcFTR54的过表达能够以独立于干扰素的方式显著抑制SVCV的复制。机制上，CcFTR54作为E3泛素连接酶，促进N蛋白在K119位点的K48连接泛素化，从而增强了N蛋白与自噬受体p62的相互作用，进而促进了p62介导的N蛋白的选择性自噬降解。重要的是，p62的敲低减弱了CcFTR54介导的N蛋白降解和抗病毒活性。总体而言，这些发现揭示了真骨鱼类中一种新的鳍TRIM介导的抗病毒机制，为宿主-病毒相互作用和水产养殖中病毒性疾病控制提供了新的见解。
引言
鲤鱼春季病毒血症（SVC）是一种由鲤鱼病毒（SVCV）引起的高度传染性的急性出血性疾病，导致鲤科鱼类（尤其是普通鲤鱼Cyprinus carpio L.）出现显著的发病率和死亡率[1]。虽然所有年龄段的鱼类都易感染SVCV，但幼鱼的症状尤为严重，报道的死亡率可高达90%，其主要表现为出血和腹部肿胀[2]。SVCV是一种属于Rhabdoviridae科的负链单链RNA病毒[3]。其基因组长度约为11 kb，编码五种结构蛋白，分别是核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和RNA依赖性RNA聚合酶（L）[4]、[5]。先前的研究表明，N蛋白是一种丰富的病毒蛋白，它与病毒RNA结合形成螺旋核衣壳结构[6]。此外，据报道SVCV N蛋白通过促进参与I型干扰素（IFN-I）产生的关键信号分子的降解来拮抗宿主的抗病毒先天免疫，从而促进病毒的复制和传播[7]、[8]。
自噬是一种进化上保守的分解代谢过程，负责降解受损的细胞器、错误折叠的蛋白质和入侵的病原体，在维持细胞稳态中起着关键作用[9]、[10]。迄今为止，已鉴定出至少三种主要形式的自噬，包括巨自噬、微自噬和伴侣蛋白介导的自噬（CMA）[11]、[12]、[13]。越来越多的证据表明，自噬可以以高度选择性的方式发挥作用，这一过程称为选择性自噬，它通过专门的自噬受体如NDP52、NBR1、OPTN、SQSTM1/p62、TOLLIP和CCDC50来靶向特定的底物[14]、[15]。作为一种重要的宿主防御策略，自噬可以被触发以将病毒颗粒或病毒成分输送到溶酶体中进行降解[16]。例如，蛋白酶体亚基β1型（PSMB1）通过促进Nsp12的选择性自噬降解来抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的复制[17]。同样，TRIM45通过调节伴侣蛋白介导的病毒PB2蛋白的自噬降解来限制流感病毒感染[18]。
三联基序（TRIM）蛋白是一类高度保守的蛋白质超家族，是RING型E3泛素连接酶中最大的亚家族[19]。该家族的成员具有特征性的结构域组成，包括一个N端Really Interesting New Gene（RING）结构域、一个或两个B-box结构域（B1/B2）和一个卷曲螺旋（CC）结构域，随后是一个或多个可变的C端结构域[20]。其中，RING结构域赋予E3连接酶活性，使TRIM蛋白能够介导特定底物的泛素化、ISG化或SUMO化，从而调节它们的定位，并参与信号复合体或将其靶向降解[21]。在哺乳动物中，大量证据强调了TRIM蛋白在先天抗病毒反应中的关键作用[22]、[23]。由于谱系特异性的全基因组复制（WGD）事件，鱼类拥有一个扩展的TRIM基因库，包含超过100个成员，包括哺乳动物同源物和鱼类特有的TRIM蛋白，称为鳍TRIMs（FTRs）[24]。先前的研究表明，几种FTR基因在病毒感染后显著上调，表明它们可能作为抗病毒免疫反应的效应因子或调节因子[25]。然而，关于FTR蛋白在鱼类抗病毒免疫中的分子和功能多样性仍缺乏全面的了解。
普通鲤鱼（Cyprinus carpio L.）是全球最重要的淡水养殖物种之一[26]、[27]。近年来，由于高密度养殖和水质恶化，普通鲤鱼经常发生疾病。因此，了解免疫相关基因在抵抗传染病中的作用尤为紧迫。在本研究中，我们从普通鲤鱼中鉴定出一种鱼类特异性的TRIM蛋白，命名为< />FTR54，其在SVCV感染后表达显著上调。功能分析显示，CcFTR54以E3泛素连接酶依赖的方式抑制SVCV的复制。机制上，CcFTR54与SVCV的N蛋白相互作用并诱导其K48连接泛素化。被泛素化的N蛋白随后被自噬受体p62识别并输送到自噬体中进行选择性降解。这项研究阐明了真骨鱼类中一种新的鳍TRIM介导的抗病毒机制，并为病毒感染与鱼类先天免疫中的选择性自噬之间的相互作用提供了新的见解。
章节片段
细胞和病毒
293T细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养温度为37°C，培养环境为含有5% CO2的湿润培养箱。Epithelioma papillosum cyprini（EPC）细胞在M199培养基中培养，培养温度为25°C，培养环境为不依赖CO2的培养箱。所有细胞系均来自我们实验室保存的库存。对于细胞转染，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen, USA）对293T细胞进行转染，而EPC
CcFTR54的生物信息学分析
SVCV感染的普通鲤鱼的转录组测序分析显示，多个TRIM16样基因的表达显著上调。为了表征它们在SVCV刺激中的潜在作用，我们选择了一个表达水平差异较大的代表性基因进行克隆和分析。我们发现该TRIM16样基因具有1344 bp的开放阅读框（ORF），编码一个448个氨基酸的蛋白质，预测分子量为51.026 kDa。讨论
在真骨鱼类中，TRIM蛋白家族，特别是鳍TRIM亚家族，经历了广泛的谱系特异性扩张，被认为是抗病毒先天免疫的关键组成部分。尽管这种多样性显著，但大多数鳍TRIM成员的功能库和分子机制仍知之甚少。在本研究中，我们从普通鲤鱼（CcFTR54）中鉴定并功能表征了一种先前未被识别的鳍TRIM蛋白，并证明了
作者贡献
RRL和HXG负责正式分析、研究方法及原始草稿的撰写；XL参与了数据分析。SJS、HL和GY参与了手稿的起草；所有作者都阅读并批准了最终稿件。
伦理声明
伦理批准和参与同意
该实验方案已获得山东师范大学动物实验伦理委员会的批准
资助
本研究得到了中国济南市-大学融合发展战略项目（JNSX2023031）的资助。
致谢
我们感谢所有提供实验室支持、技术协助和建议的实验室成员。
