《Fish & Shellfish Immunology》：Functional Characterization of Interferon-Induced Protein 44-Like in
Amphiprion clarkii: Expression Profiles, Immunomodulatory Activity, and Antiviral Function
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本研究鉴定了黄尾 clownfish的IFI44L同源基因AcIFI44L，发现其编码的蛋白质具有TLDc和MMR_HSR1保守结构域。在病毒和细菌免疫刺激下，AcIFI44L在血细胞、脾脏和鳃中高表达。过表达AcIFI44L显著抑制VHSV增殖，降低病毒滴度，并增强NF-κB信号通路，证实其在鱼类抗病毒免疫中的关键作用。
作者名单：Yasara Kavindi Kodagoda、D.C.G. Rodrigo、U.P.E. Arachchi、E.M.T. Tharanga、H.A.C.R. Hanchapola、D.M.K.P. Sirisena、D.S. Liyanage、W.K.M. Omeka、Jeongeun Kim、Taehyug Jeong、Gaeun Kim、Qiang Wan、Jihun Lee、Jehee Lee
韩国济州国立大学海洋生命科学系与基因组选择中心，济州63243
摘要
干扰素诱导蛋白44类似物（IFI44L）是一种受干扰素刺激的基因（ISG），通过调节宿主的先天免疫反应在抗病毒防御中发挥关键作用。本研究在黄尾小丑鱼（Amphiprion clarkii）中鉴定并功能表征了IFI44L的同源基因（AcIFI44L）。AcIFI44L基因长度为1,350个碱基对，编码含有两个保守结构域（TLDc和MMR_HSR1）的449个氨基酸的多肽。AcIFI44L在Peripheral blood cells中的表达量最高，其次为脾脏和鳃组织，并且在病毒和细菌免疫刺激下显著上调。在脂肪头鲦鱼细胞中过表达AcIFI44L显著抑制了病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的复制，表现为病毒转录本减少、病毒滴度下降以及关键抗病毒基因的表达变化，表明其具有强大的抗病毒效果。流式细胞术结果显示，AcIFI44L过表达减少了VHSV引起的细胞病变并提高了细胞存活率。此外，AcIFI44L增强了NF-κB依赖的萤光素酶活性，并增加了NFκB1（p50）和RELA（p65）的转录水平，这与其在硬骨鱼类细胞中增强NF-κB信号传导的作用一致。这些发现揭示了IFI44L在鱼类中的物种特异性抗病毒作用，并强调了其作为水产养殖物种病毒性疾病治疗靶点的潜力。
引言
病毒感染对野生和养殖鱼类种群构成了严重威胁，因此人们对其防御机制进行了广泛研究[1][2]。干扰素刺激基因（ISGs）是一类在对抗病原体（尤其是病毒）的先天免疫反应中起关键作用的基因[3]。这些基因在病原体被检测到后由干扰素（IFNs）激活，在细胞内建立抗病毒状态[4]。ISGs通过针对病毒的不同生命周期阶段（包括进入、脱壳、复制和释放）有效抑制病毒复制，是干扰素介导的抗病毒保护的关键效应因子[5]。
IFI44L属于IFI44蛋白家族，该家族属于ISGs的更广泛分类[6]。IFI44家族通过调节抗病毒防御和调控干扰素信号通路在细胞内在免疫系统中发挥重要作用[7]。先前的研究表明，IFI44L参与哺乳动物的多种生物过程，包括炎症、组蛋白修饰、甲基化、程序性细胞死亡、磷酸化、细胞增殖、细胞外基质形成和细胞信号传导[6]。
IFI44L在调节病毒复制和决定宿主先天免疫方面具有双重作用：高表达的IFI44L可抑制日本脑炎病毒（JEV）的复制[6]；在呼吸道合胞病毒（RSV）感染中，IFI44L及其同源基因IFI44可限制病毒感染并减少基因组复制或转录[8]；人类IFI44L还能抑制丙型肝炎病毒（HCV）的复制，表明其对多种RNA病毒具有抗病毒能力[9][10]。最近对猪IFI44L的研究显示，它对传染性胃肠炎病毒（TGEV）具有强抗病毒活性，能抑制病毒复制并激活I型干扰素信号通路[11]。然而，在甲型流感病毒（IAV）、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）和人类冠状病毒229E（HCoV-229E）感染期间，IFI44L表现出促进病毒复制的效应[12]。这种功能双重性源于IFI44L作为先天免疫信号负反馈调节因子的作用。人类IFI44L与FKBP5蛋白相互作用，抑制IKKε和IKKβ激酶的活性，从而抑制IRF3和IBKα的磷酸化，减弱下游的干扰素和NF-κB反应[6]。作为典型的ISG，IFI44L的表达通过Janus激酶-信号转导子和转录激活因子介导，当STAT1和STAT2与其启动子中的干扰素刺激响应元件结合时被诱导，使其参与抗病毒防御机制，同时提供负反馈以防止免疫过度激活[12]。总体而言，这些研究表明IFI44L既能支持宿主的抗病毒防御，也能在某些情况下促进病毒复制，突显了其在病毒复制和先天免疫调节中的复杂机制。
黄尾小丑鱼（Amphiprion clarkii）是一种广泛分布于印度-西太平洋地区的物种，在水族贸易中因其鲜艳的颜色形态和易于人工繁殖而受到重视[14][15]。其快速生长、适应性和遗传多样性使其成为生态进化研究的重要模型[16][17]。尽管IUCN将其列为无危物种，但A. clarkii仍易受气候变化、栖息地破坏和过度捕捞的影响。病原体爆发会导致水族箱中的严重损失，尤其是对A. clarkii而言，因为它们对水质差、过度拥挤、攻击性强的同笼鱼类及快速的环境变化非常敏感[18]。病毒性疾病（如淋巴囊肿病病毒）会在鳃盖、皮肤等部位引起结节性病变，导致高发病率和死亡风险[19]；细菌性疾病（如由Vibrio harveyi、Vibrio alginolyticus和Vibrio parahaemolyticus引起的弧菌病）会导致尾部腐烂、皮肤溃疡和全身感染[20]。病毒性出血性败血症病毒（VHSV）是一种属于Novirhabdovirus属（Rhabdoviridae科）的负链单股RNA病毒，是一种高度致病性的弹状病毒，可感染多种淡水和海水硬骨鱼类，导致病毒性出血性败血症，其特征是全身出血、贫血、腹水和高死亡率，临床症状包括嗜睡、眼球突出、皮肤变暗以及内脏器官的瘀点或瘀斑出血[21]。这些感染会降低水产养殖和野生渔业的产量和经济效益。因此，全面研究A. clarkii对病毒和细菌病原体的免疫防御机制对于减少疾病爆发和促进可持续的水族养殖至关重要[22]。
本研究表征了A. clarkii中IFI44L同源基因（AcIFI44L）的结构、表达和功能。在正常和免疫刺激条件下分析了不同组织中的AcIFI44L表达情况，并通过靶向功能测定（包括病毒复制和细胞活力评估）评估了其抗病毒活性。通过转录分析研究了病毒感染后AcIFI44L过表达鱼类细胞中的病毒转录本水平以及参与干扰素信号传导、模式识别和NF-κB通路的关键宿主抗病毒基因的表达。萤光素酶报告基因实验用于评估NF-κB启动子活性，从而揭示了AcIFI44L介导的免疫信号传导机制。这些发现为了解AcIFI44L在鱼类中的免疫调节和抗病毒作用提供了新的见解，推动了我们对硬骨鱼类先天免疫机制的理解。
AcIFI44L的鉴定和计算机模拟分析
AcIFI44L的编码序列来自韩国济州国立大学之前建立的A. clarkii转录组文库[23]，并通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站的基本局部比对工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行了验证。使用多种计算机模拟分析工具描述了该序列的特征。
AcIFI44L的开放阅读框（ORF）及其推导出的氨基酸序列
AcIFI44L的鉴定和计算机模拟分析
AcIFI44L的ORF长度为1,350个碱基对，编码449个氨基酸组成的多肽链，预计分子量为50.15 kDa，等电点为6.89。AcIFI44L序列已提交至NCBI GenBank，登录号为PX733327。蛋白质结构预测显示其包含两个主要结构域：一个TLDc结构域（具有β-夹心折叠结构，两侧各有一个螺旋结构）和一个Ras样GTP酶结构域。
讨论
本研究重点研究了A. clarkii中的IFI44L基因的分子和功能特性，旨在阐明其在免疫反应中的作用，特别是抗病毒功能。IFI44L作为一种已知的ISG，在哺乳动物中已被广泛研究，发现它能调节I型和III型干扰素反应及抗病毒活性[6][34]。然而，尽管抗病毒防御对水产养殖物种至关重要，但其在鱼类免疫系统中的分子功能仍大多未被探索。
CRediT作者声明
Yasara Kavindi Kodagoda：概念提出、方法设计、实验实施、初稿撰写。
D.C.G. Rodrigo：方法设计、实验实施。
U.P.E. Arachchi：方法设计、实验实施。
E.M.T. Tharanga：方法设计、实验实施。
H.A.C.R. Hanchapola：方法设计、实验实施。
D.M.K.P. Sirisena：方法设计、实验实施。
D.S. Liyanage：监督、撰写及审稿编辑。
W.K.M. Omeka：监督、撰写及审稿编辑。
Jeongeun Kim：监督、实验实施。
Taehyug Jeong：...
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）基础科学研究计划（项目编号RS-2019-NR040078）和韩国海洋科学技术促进院（KIMST）的支持，后者由韩国海洋渔业部资助（项目编号RS-2022-KS221670）。
