共轭亚油酸（CLA）是一类含有共轭双键的十八二烯酸[1]。这些双键的位置和构型的不同导致了多种异构体的产生。其中，顺式9,反式11-CLA（c9, t11-CLA）和反式10,顺式12-CLA（t10, c12-CLA）是研究最广泛且生理活性最强的异构体[2]。c9, t11-CLA表现出多种生物活性，包括抗炎作用和抑制癌细胞增殖[3]。目前，天然来源（如乳制品）中的CLA含量有限[4]。虽然化学合成可以实现高产量的生产，但它会产生多种CLA异构体的混合物[5]。最近的研究表明，不同CLA异构体的共存可能导致相互拮抗的生理效应[6]。因此，高效生产单一异构体的CLA具有重要意义。
最近的研究发现了几种能够将亚油酸（LA）转化为CLA异构体的乳酸菌，包括Lactobacillus reuteri[7]、Lactobacillus plantarum[8]和Bifidobacterium spp[9]。迄今为止，已经发现了几种亚油酸异构酶。例如，Propionibacterium acnes PAI能高效地将LA转化为t10, c12-CLA[10]，而Lactiplantibacillus plantarum通过多酶级联系统实现转化[11],[12]。先前的研究证实，从婴儿肠道中分离出的Bifidobacterium breve CCFM683菌株能够高效地将c9, t11-CLA转化为CLA，转化率超过90%[13]。进一步的机制研究表明，这种活性归因于一种名为BBI的独特亚油酸异构酶[3]，它能够在单一步反应中将LA转化为c9, t11-CLA。然而，在B. breve所需的严格厌氧条件下，BBI的表达水平较低，这成为功能研究和实际应用的主要瓶颈。此外，酶法生产CLA在工业应用中面临挑战，如底物/产物的水溶性低以及需要高活性和稳定的生物催化剂。
我们实验室之前的工作为BBI的异源表达奠定了基础。首先，Li等人[14]在Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris中评估了BBI的表达情况，证明P. pastoris是生产BBI的最佳宿主。此外，Mei等人[15]研究了BBI上标签的融合位置，发现C末端融合10×HIS标签可以增强BBI的表达，而N末端融合则显著抑制了其表达。结构预测分析表明，这种抑制可能是由于BBI的N末端靠近活性位点，标签融合可能干扰底物结合。基于这些发现，我们的团队在P. pastoris中成功构建了BBI-3CZHEK-10×HIS表达系统[14]。
尽管在宿主选择和标签工程方面进行了优化，BBI的功能表达产量仍然较低。我们发现BBI的固有特性是核心问题：它是一种具有九个跨膜结构域（TMDs）的膜蛋白[15]。在异源系统中，这些TMDs的高疏水性经常导致蛋白质聚集并形成无催化活性的包涵体。这种“溶解度瓶颈”不仅阻碍了机制研究，也限制了酶法CLA生产的规模[16]。与许多依赖二硫键稳定性的球状酶不同，BBI的结构完整性是通过磷脂双层中的α-螺旋整合来维持的。这类异构酶的催化机制通常涉及灵活的环状区域，有助于在亚油酸转化过程中稳定过渡态。这些构象状态之间的转换对酶功能至关重要。膜蛋白的固有疏水性要求它们在合成后穿过水溶性细胞质环境并整合到膜中[17]。此外，提取过程需要使用表面活性剂将它们从膜结构中分离出来[18]。这些特性导致了常见的困难，如低溶解度表达水平、易聚集性和在实验系统中的稳定性差。我们假设BBI的疏水性质和复杂的折叠结构是难以获得具有正确构象和生物活性的大量BBI蛋白的主要原因。因此，开发一种有效的可溶性表达策略以克服BBI的溶解度限制至关重要。
使用融合标签是解决膜蛋白疏水性相关挑战的常见策略[19]。在蛋白质的C端或N端添加亲水标签可以提高膜蛋白的溶解度，从而增加其表达水平[20],[21]。在各种亲水标签中，NusA被广泛认为是能够显著提高异源蛋白可溶性表达的融合伴侣[22]，特别是那些容易聚集的蛋白[23]。研究表明，NusA可以将融合蛋白的可溶性比例提高到50–90%[24]。最初用于解决Escherichia coli中的包涵体形成问题[24]，这种溶解性质由于其较大的体积和类似伴侣蛋白的活性而得到成功应用，现已用于提高膜蛋白的溶解度[25]。例如，大多数含有黄素的单加氧酶（FMOs）与NusA融合后变得可溶[26]。同样，Yang等人[22]证明，在E. coli中表达NusA-MlrA融合模块显著提高了膜蛋白MlrA的溶解度和稳定性。尽管NusA最初来源于E. coli，但其溶解效果主要归因于其高内在溶解性和作为生物物理伴侣蛋白的能力。NusA通过增加净电荷和提供立体阻碍来防止多肽聚集，这一过程不依赖于宿主特定的折叠机制[27]。虽然在酵母中较为罕见，但NusA在其他真核宿主（如鳞翅目昆虫细胞[28]中的成功应用为其在Pichia pastoris中的使用提供了先例。这些发现为在工程真核宿主中应用NusA以提高BBI的可溶性表达提供了坚实的理论依据。
基于这一背景，选择NusA来提高BBI的可溶性表达。选择FLAG标签（序列：DYKDDDDK）是为了便于在不同构建体之间进行一致的免疫检测和纯化，因为它具有高检测灵敏度（由于抗体非特异性结合少），并且具有天然的肠激酶识别位点（DDDDK*），允许潜在的标签去除[29]。为了系统地评估NusA的溶解效果，我们在P. pastoris中构建了BBI-FLAG-NusA融合蛋白，并设置了两个对照构建体：BBI-FLAG（用于评估NusA的效果）和BBI-10×HIS（作为我们之前系统的基准）。在实验系列（BBI-FLAG, BBI-FLAG-NusA）中使用FLAG标签确保了均匀且高度敏感的检测，从而分离出感兴趣的变量（NusA的存在）。这一策略旨在实现BBI的高活性可溶性表达，为大规模生产c9, t11-CLA奠定基础，并促进后续的机制研究和应用工艺开发。
