《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：New methods for killing spores of
Bacillota that may have applied utility
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Bacillota孢子因独特结构（外衣、钙吡啶二羧酸储库、低含水量核心）及抗逆机制（如蛋白交联、SASP保护DNA）极难灭活。传统热处理易导致食品性质劣变，近年探索化学灭孢剂（如过氧乙酸）和物理方法（等离子体），但效果有限。新兴策略“萌发-灭活”通过诱导孢子萌发（利用氨基酸/糖分子触发CaDPA释放通道），使其抗性丧失，再用温和加热灭活，兼具高效与食品安全性。
彼得·塞特洛|格雷厄姆·克里斯蒂
康涅狄格大学健康科学学院分子生物学与生物物理学系，美国康涅狄格州法明顿06030
摘要
属于芽孢菌门（Bacillota）的孢子包含多种对经济和公共卫生具有重要影响的细菌物种，它们是自然界中最耐久且最难以杀死的微生物之一。这些孢子之所以具有极强的抵抗力，是因为其独特的细胞结构和生理特性使它们能够在代谢上处于休眠状态，同时仍能迅速恢复到可繁殖的状态并可能造成危害。本文综述了当前用于杀灭或根除这些孢子的方法和技术，重点介绍了适用于食品工业的技术。这些方法包括新型化学杀菌剂以及物理处理手段，旨在规避传统热处理方法对食品品质的负面影响。尽管在这些领域取得了进展，但我们认为“通过诱导孢子萌发来消灭它们”的策略可能更适合在食品工业中广泛应用，这一策略基于近年来对孢子萌发机制的分子水平理解，并为设计能够有效触发所有芽孢菌门孢子萌发的小分子提供了理论基础。
引言
多种芽孢菌门（以前称为厚壁菌门，Firmicutes）物种的孢子通过孢子形成过程产生。当孢子在母细胞中成熟后，母细胞会裂解，释放出孢子到培养基中；这些孢子随后可能进一步成熟（Abhyankar等人，2015年；Sanchez-Salas、Setlow、Zhang、Li和Setlow，2011年）。这些孢子在代谢上是休眠的，无法自行合成氨基酸或核苷酸（Setlow和Christie，2025年）。然而，在适宜条件下，孢子可以“重新活跃”并萌发，进而转化为可繁殖的细胞（Li等人，2025年；Zhang、Gong、Zhou、Rao和Liao，2025年）。尽管如此，由于某些孢子种类能够导致食品变质、食物中毒或人类疾病（如炭疽、腹泻或破伤风），因此如何有效杀灭这些孢子一直是一个重要的研究课题。多年来，科学家们致力于研究孢子的特性及最佳杀灭方法，以防止其带来的危害。
芽孢菌门的孢子具有与生长中的细胞截然不同的结构（见图1）。从外到内，某些（但并非所有）物种的孢子最外层有一层主要由糖蛋白组成的外孢壁（Ball等人，2008年；Gerhardt和Ribi，1964年）。外孢壁之下是一层蛋白质层，其中许多蛋白质高度交联（Abhyankar等人，2015年；Kobayashi、Kumazawa、Miwa和Yamanaka，1996年），接着是一层功能尚不明确的外膜（Setlow，2016年），然后是一层含有大量甘氨酸内酰胺（MAL）的肽聚糖（PG）皮质（Warth和Strominger，1969年），再是一层不含MAL的PG层，最后是一层脂质流动性较低的内膜（Cowan等人，2004年；Knudsen等人，2016年；Sunde、Setlow、Hederstedt和Halle，2009年）。内膜包裹着孢子核心，那里包含孢子的DNA、RNA和大部分酶。值得注意的是，许多促进孢子萌发的关键蛋白质嵌入或位于内膜中（Zhang等人，2025年）。孢子核心还含有约20%干重的Ca2+和二吡啶酸（CaDPA）螯合物，这些物质在孢子形成后期从母细胞中被吸收（Daniel和Errington，1993年）。这种吸收以及核心的压缩使得核心中的水分含量降至干重的20%左右（Gerhardt和Marquis，1989年）。在所有CaDPA通过内膜中的通道蛋白释放后，皮质会迅速降解（Gao等人，2022年；Velásquez、Schuurman-Wolters、Birkner和Poolman，2014年）。这种降解过程由孢子外层中的皮质降解酶完成，这些酶仅作用于含有MAL的PG部分，从而保护不含MAL的芽孢壁PG（Popham、Helin、Costello和Setlow，1996年）。缺乏外孢壁的孢子中，如溶菌酶等物质通常会导致孢子死亡。
不幸的是，杀灭孢子非常困难，因为它们对许多潜在致命的处理方法具有极强的抵抗力，包括湿热、干热、紫外线（UV）和γ射线，以及多种有毒化学物质（Setlow，2006年；Setlow和Christie，2021年）。孢子的多种特性使其具有极高的抗性，具体包括：（1）厚实的蛋白质外孢壁能阻挡化学物质，并阻止大于12 kDa的分子进入孢子内部；（2）孢子外孢壁和/或外膜中的色素可保护孢子免受紫外线辐射；（3）孢子内膜对带电分子的渗透性极低，减缓了有毒物质（如过氧化氢）进入孢子核心的进程；（4）孢子DNA中存在的一类小分子（SASP）可保护DNA免受紫外线和γ射线的损伤。然而，SASP在孢子萌发早期会被特定的内切酶GPR降解，从而解除对DNA的抑制，使其能够进行转录并促进细胞生长（Sanchez-Salas等人，1992年）。如果SASP不被降解，萌发的孢子将无法存活（Sanchez-Salas等人，1992年）。因此，开发特定的GPR抑制剂可以显著加速孢子的杀灭过程。另一个重要因素是孢子核心中的水分含量极低，通常仅为干重的20%，而生长中的细胞水分含量约为80%。这种低水分含量使孢子对湿热具有更强的抵抗力（Gerhardt和Marquis，1989年；Popham、Sengupta和Setlow，1995年）。孢子核心水分含量低是由于外孢壁的交联作用导致核心体积减小，以及孢子形成后期吸收了约20%干重的CaDPA和水分。此外，孢子中的高CaDPA含量也增强了其抗紫外线能力（Douki、Setlow和Setlow，2005年）。孢子萌发初期，所有CaDPA会通过位于内膜的CaDPA通道释放到培养基中，这些通道由spoVA基因编码。这些通道在孢子形成后期也参与CaDPA的吸收（Gao等人，2022年）。CaDPA的释放是孢子萌发的首个可检测到的现象，此时孢子的抗性会丧失。因此，找到能够激活内膜CaDPA通道的化学物质可能有助于有效杀灭孢子（Setlow和Christie，2021年）。
自然而然地，人们一直在寻找更有效、更具创新性的杀孢方法。这些研究通常遵循以下三种途径：（1）研究新的化学物质或混合物对孢子的杀灭效果；（2）开发不使用有毒化学物质的创新杀孢方法；（3）研究如何快速诱导孢子萌发，因为萌发的孢子已失去抗性，因此更容易被杀死（即“通过诱导萌发来灭活”的策略）。在过去约25年中，这三个领域都取得了新的进展（见下文）。
新杀菌剂
许多新型杀菌剂已被证明能有效杀灭孢子，通常通过测试其对枯草芽孢杆菌（B. subtilis或蜡样芽孢杆菌（B. cereus）孢子的效果来验证。这些新杀菌剂包括：i) 如环氧乙烷、蒸汽中的甲醛和羟基自由基等气体（Bai、Zhang、Tian和Bai，2012年；Kanemitsu等人，2005年；Rutala、Gergen和Weber，1998年）；ii) 含有毒化学物质的溶液，例如液态过氧乙酸（Leggett等人，2015年；Leguérinel、Mathot和Camarero等人）。
新型杀孢技术
除了化学方法外，还开发了多种非化学性的杀孢技术，通常结合多种处理方式（Chiozzi、Agriopoulou和Varzakas，2022年）。最近的一些例子包括：（1) 各种类型的等离子体（Ezzati等人，2025年；Hu等人，2024年；Kanemitsu等人，2005年；Machková等人，2025年；Rutala等人，1998年；Sharma、Pruden、Yu和Collins，2005年；Shi等人，2009年）。
“通过诱导萌发来消灭孢子”的方法
有多种方法可以触发孢子萌发。例如，可以通过引入特定的小分子（如丙氨酸或缬氨酸）或糖类（如葡萄糖或果糖）来诱导萌发（Setlow和Christie，2021年）。这种方法已被证明可以减少土壤中的孢子数量，因为萌发的孢子会因缺乏营养而死亡（Bishop，2014年；Schelkle等人，2017年）。未来发展方向
所有这些研究都引发了关于如何更有效地处理孢子的问题，尤其是在食品领域。目前看来，不太可能找到一种既能杀灭孢子又不对消费者产生不良影响的万能方法。当然，分析孢子的特性对于开发新的杀孢策略至关重要。CRediT作者贡献声明
彼得·塞特洛：负责撰写综述和编辑内容，以及初稿的撰写和概念构思。格雷厄姆·克里斯蒂：同样负责撰写综述和编辑内容，以及初稿的撰写。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
