《Chemical Physics Letters》：Nucleotide discrimination upon DNA immobilization in graphene nanopore sequencing
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石墨烯纳米孔中DNA固定化会降低离子电流对比度达90%，因动态离子屏蔽云被破坏。平衡DNA移动速度与信号质量是优化测序的关键。
法里巴·沙菲伊（Fariba Shafiei）|梅赫兰·瓦埃齐（Mehran Vaezi）|纳尔吉斯·尼库法德（Narges Nikoofard）|S·梅赫迪·瓦埃兹·阿拉埃（S. Mehdi Vaez Allaei）
伊朗卡尚大学纳米科学与纳米技术研究所，卡尚 87317-53153
摘要
固态纳米孔测序需要足够的停留时间以实现碱基分辨率。这促使人们研究延长DNA在传感区域内的停留时间的策略。在这里，我们使用全原子分子动力学方法，比较了移动型与固定型单链DNA（ssDNA）在石墨烯纳米孔中的离子电流特征。研究发现，尽管固定化可以最大化停留时间，但会降低核苷酸电流对比度高达90%，并降低信噪比。这种现象源于移动DNA所拖动的动态离子屏蔽云的消失。我们的结果表明，DNA的移动性对信号生成至关重要，这意味着最佳的减速策略必须保持局部离子与DNA的协同运动。
引言
基于纳米孔的DNA测序已成为基因组分析中的颠覆性技术。它具有许多优势，包括极长的读取长度和高度便携的仪器[1]。该技术的空间分辨率主要由纳米孔的传感区域决定，这直接影响测序精度[2]。纳米孔技术已显示出超出DNA测序的多重应用[3]。
先进纳米材料的发展不断提升了DNA测序技术的能力。目前，生物纳米孔在商业应用中占据主导地位。然而，生物纳米孔的局限性（如稳定性有限以及无法精确控制传感区域）促使人们广泛研究固态替代方案。
石墨烯作为研究最为深入的二维材料，在纳米孔传感应用中具有独特优势。其原子级厚度、电绝缘性和在离子溶液中的卓越稳定性使其成为下一代测序平台的理想候选材料[4]。石墨烯纳米孔的传感区域可与单个核苷酸的物理尺寸相当，接近单碱基分辨率的基本极限[5]。然而，在优化石墨烯纳米孔以适应实际测序应用方面仍存在重大挑战。
在过去三十年中，DNA通过纳米孔的迁移过程已被广泛研究，众多因素影响其迁移动态。这些因素包括纳米孔的几何形状[6]、表面修饰[8]、大分子拥挤[9]、聚合物的固有性质[11]以及孔入口处的DNA捕获机制[12][13]。全面理解石墨烯纳米孔中的迁移机制对于开发可靠的测序应用至关重要[14]。
已经提出了多种用于DNA测序的石墨烯纳米结构[15][16]以及由其他二维材料制成的纳米孔[17]。单层石墨烯纳米孔已证明能够分辨DNA链中的单个核苷酸[18]。石墨烯的超薄特性减少了邻近核苷酸对所检测核苷酸离子电流信号的干扰，从而提高了信噪比和时间分辨率[19]。然而，石墨烯纳米孔在低频下的噪声水平较高，这在某些应用中会影响灵敏度[20]。
基于石墨烯纳米孔的测序中的一个关键挑战是控制DNA的迁移速度。为了实现准确的碱基识别，需要减缓DNA的迁移速度。在传统的固态纳米孔中，DNA的迁移速度通常过快（在微秒时间尺度上）。快速迁移使得当前的检测系统无法分辨单个核苷酸[2]。
为了解决这一限制，人们开发了多种减缓迁移速度的策略。减小纳米孔尺寸[21]、设置物理障碍[22]、进行分子修饰[23]、使用纳米颗粒阻塞[24]、调整盐浓度[25]以及控制电压或温度[26][27][28]等方法都已被成功应用。这些方法显著延长了DNA的停留时间。
电渗流（EOF）是指当外加电场作用于带电表面附近的电双层中的反离子时产生的流体运动。在减缓DNA迁移速度的方法中，利用EOF是一种有效的策略。EOF主要由表面电荷不对称性驱动，并可通过pH值、离子强度或化学修饰进行调节。
EOF可以抑制或增强电泳力，从而减缓甚至逆转生物分子通过纳米孔的运动[45][46][47][48][49]。例如，具有适当电荷分布的工程化蛋白质孔通过平衡EOF和静电力，实现了超过20倍的ssDNA减速[48]。固态系统利用EOF来提高捕获效率并降低石墨烯和SiN?纳米孔中的DNA迁移速度[46][47][49]。
然而，一个基本问题仍未得到充分探讨：虽然减缓DNA迁移速度对于提高测序精度是必要的，但过度减速是否会降低区分核苷酸所需的离子电流对比度？以往的研究主要评估了这些策略增加停留时间的能力，而没有系统地评估它们对信号质量的影响[21][26][28]。这一疏忽是一个关键的知识空白，因为离子信号的质量对于可靠的碱基识别至关重要。
实际上，纳米孔中的碱基识别主要依赖于围绕DNA的离子屏蔽云。反离子在带电生物分子（如DNA）附近形成动态的屏蔽“云”。屏蔽云的特征厚度由德拜长度决定，取决于体相离子浓度[29]。这种动态离子云在塑造通过纳米孔的离子电流中起着核心作用。
在这项研究中，我们利用全原子分子动力学模拟研究了DNA固定化对离子电流质量和碱基识别的影响。模拟考虑了单链DNA（ssDNA）通过石墨烯纳米孔的迁移过程。DNA的固定化代表了比模拟时间更长的核苷酸停留时间。我们特别探讨了DNA的移动性如何影响离子电流特征和核苷酸的区分能力。
我们的方法研究了两个相关方面：(i) ssDNA与石墨烯纳米孔边缘之间的疏水相互作用；(ii) 随后探讨了DNA移动性与离子电流信号质量之间的关键关系。研究发现了一个之前未被认识到的权衡：虽然减缓迁移速度对测序是必要的，但完全固定DNA会导致核苷酸之间的离子电流对比度大幅下降（高达90%），并且信噪比（SNR）也显著降低。
我们的结果表明，最佳的纳米孔测序需要在迁移速度和信号完整性之间找到平衡。这一原则为下一代测序平台的设计提供了重要指导。本文的其余部分结构如下：第2节介绍计算方法，第3节展示结果和讨论，第4节对结果进行总结。
我们进行了全原子分子动力学（MD）模拟，以研究单链DNA（ssDNA）通过石墨烯纳米孔的迁移动态。如图1所示，模拟系统包括一个带有中心纳米孔的石墨烯膜、ssDNA分子和1 M NaCl电解质溶液。为了清晰起见，可视化图中省略了水分子，但在所有模拟中都实际包含了水分子。
模拟盒被设置为一个立方体，其尺寸为...
我们的模拟显示，ssDNA与石墨烯纳米孔之间存在复杂的相互作用。这些相互作用主要由核苷酸与石墨烯表面之间的堆叠以及减少溶剂化能量的疏水相互作用驱动。这些相互作用影响迁移动态，在纳米孔测序应用中必须加以考虑。
为了研究这些相互作用，我们使用了相同的参数进行了四次独立模拟。
本研究揭示了DNA迁移动态与石墨烯纳米孔测序中离子电流特征之间的基本关系。通过分子动力学模拟，我们发现了一个之前未被认识的权衡，这为纳米孔测序的优化提供了新的思路。
重要的是，本研究并不认为所有减缓迁移速度的策略都会降低信号质量。相反，它指出了一个根本性问题...
法里巴·沙菲伊（Fariba Shafiei）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、数据分析、正式分析、数据管理。梅赫兰·瓦埃齐（Mehran Vaezi）：撰写 – 初稿撰写、软件开发、方法论设计。纳尔吉斯·尼库法德（Narges Nikoofard）：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、项目管理、概念构思。S·梅赫迪·瓦埃兹·阿拉埃（S. Mehdi Vaez Allaei）：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督。
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
