《ACS Applied Bio Materials》：Engineering a Bioactive PMMA–Silica Hybrid Scaffold for Enhanced Bone Regeneration
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本研究旨在克服聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）在骨组织工程（BTE）中缺乏生物活性和骨整合能力的局限性。通过引入正硅酸乙酯（TEOS）作为二氧化硅源和3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）作为偶联剂，成功合成了PMMA-二氧化硅（Si）杂化支架。in vitro和in vivo实验表明，该支架显著增强了细胞粘附、增殖、成骨分化（如ALP活性）及颅骨缺损模型中的骨再生，结合了PMMA的机械稳定性与二氧化硅的生物活性，为骨缺损修复提供了一种有前景的候选材料。
1. 引言
骨骼健康对于维持机体的活动性、结构完整性和整体健康至关重要。然而，与骨骼相关的手术是全球第二常见的组织移植类型，每年有大量患者需要骨替代物，带来了巨大的社会经济负担。自体移植被视为骨修复的“金标准”，但其来源有限且可能伴随供区并发症。同种异体移植则存在感染、免疫排斥等风险。这些挑战凸显了骨组织工程（BTE）作为替代策略的重要性。在BTE策略中，基于支架的方法展现出巨大潜力。
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）作为一种合成聚合物，因其生物相容性、易于加工和成本效益，在BTE领域备受关注，常用作关节置换术中的骨水泥以及骨填充物。然而，PMMA缺乏生物活性，难以与骨组织主动结合，这可能导致植入物与周围骨之间形成非结合界面，甚至产生厚的纤维组织层，阻碍直接整合，最终可能导致植入物松动和失败。为了克服这些限制，杂化材料（结合有机和无机组分的材料）应运而生。特别是二氧化硅基杂化材料，因其能增强生物材料活性而受到重视。研究表明，硅元素能刺激I型胶原蛋白生成、促进成骨分化，在骨修复中发挥积极作用。
基于此，本研究旨在开发一种PMMA-二氧化硅杂化支架，将PMMA的机械稳定性与二氧化硅的生物活性相结合，以改善骨愈合和骨整合。研究通过in vitro细胞实验评估支架的生物性能，并利用SD（Sprague-Dawley）大鼠颅骨缺损模型进行为期12周的in vivo骨再生评估。
2. 材料与方法
研究中使用的材料包括甲基丙烯酸甲酯（MMA）、偶氮二异丁腈（AIBN）、3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTMS）、正硅酸乙酯（TEOS）等。细胞实验使用了小鼠成纤维细胞（L929）和大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）。
2.1. 支架的合成与表征
通过调节PMMA与TEOS/GPTMS的比例，合成了三种不同组成的PMMA-二氧化硅杂化支架：70% PMMA–Si、60% PMMA–Si和50% PMMA–Si，并以纯PMMA（100% PMMA）作为对照。合成过程始于TEOS和GPTMS的混合与水解，随后加入MMA和AIBN引发聚合，最终形成固化的杂化支架结构。对支架进行了全面的表征，包括：衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析化学基团；扫描电子显微镜（SEM）观察形貌和微观结构；能量色散X射线光谱（EDX）分析元素组成；万能试验机（UTM）评估压缩性能；热重分析（TGA）确定无机-有机重量百分比；X射线衍射（XRD）进行物相鉴定；原子力显微镜（AFM）测量表面粗糙度；以及通过静滴法测量水接触角评估表面润湿性。
2.2. 体外细胞研究
通过CCK-8法评估L929细胞和rBMSCs在支架上的细胞毒性（细胞活力）。通过钙黄绿素-AM染色和共聚焦荧光显微镜观察rBMSCs在支架上的粘附与分布。通过测定碱性磷酸酶（ALP）活性来评估支架的成骨潜能。
2.3. 体内研究
动物实验获得了长庚纪念医院（桃园市，台湾）伦理委员会的批准。在SD大鼠背部皮下植入支架3周后，收集组织进行苏木精-伊红（H&E）染色，以评估组织反应和纤维囊形成。此外，在大鼠颅骨上制造5毫米的临界尺寸缺损（CSD），分别植入100% PMMA和50% PMMA–Si支架。在术后第1、2、4、8和12周通过显微CT（micro-CT）扫描评估骨再生情况，并对收获的颅骨样本进行H&E和马松三色（MT）染色，进行组织学分析。
3. 结果与讨论
3.1. 支架制备与表征
所有支架均呈现光滑、结构良好的白色外观。SEM图像显示，所有样品无论二氧化硅浓度如何，均呈现多孔形态，平均孔径在16.8至18.8微米之间。微孔性增加了比表面积和渗透性，有利于细胞相互作用。元素映射证实二氧化硅均匀分布在支架中。EDX分析显示，硅含量随前驱体浓度增加而增加。XRD图谱证实PMMA和杂化样品均为无定形结构。FTIR光谱证实了聚合物和二氧化硅基团的存在。
压缩应力-应变曲线显示，所有支架的力学性能与骨小梁（杨氏模量50-500 MPa）相当。然而，随着二氧化硅浓度的增加，杨氏模量和极限应力降低，这可能与TEOS和GPTMS添加过量导致脆性增加有关。纳米压痕结果也显示，随着二氧化硅含量增加，表面模量、硬度和刚度呈下降趋势。TGA分析显示，杂化样品在热分解后残留二氧化硅，残留量随二氧化硅含量增加而增加。
AFM分析表明，纯PMMA表面相对光滑，而杂化样品的表面粗糙度随二氧化硅浓度增加而显著增加。表面粗糙度有利于成骨细胞粘附。水接触角测量显示，所有样品均呈亲水性，且杂化样品的接触角更小（亲水性更强），这有利于细胞粘附。
3.2. 体外细胞研究
CCK-8实验表明，L929细胞和rBMSCs在所有样品上的存活率均超过80%，符合生物相容性标准。但纯PMMA的细胞存活率低于杂化样品，可能与其生物活性低和残留单体毒性有关。荧光图像显示，与纯PMMA相比，rBMSCs在PMMA-二氧化硅支架上的粘附和铺展显著增强，细胞密度和覆盖度随二氧化硅含量增加而增加，这归因于表面粗糙度和亲水性的改善。
ALP活性测定显示，在培养第7天和第14天，含硅的杂化支架（尤其是50% PMMA–Si和60% PMMA–Si）的ALP活性显著高于纯PMMA和对照组。这表明二氧化硅的掺入增强了rBMSCs的成骨分化。基于体外研究结果，50% PMMA–Si复合材料因其优异的生物相容性和生物活性被选为后续体内研究的候选材料。
3.3. 体内研究
皮下植入21天后的H&E染色显示，对照组组织正常。纯PMMA和50% PMMA–Si组在植入部位均观察到中央空腔（支架移除后）和周围的纤维囊，这是一种典型的异物反应。重要的是，两组均未观察到炎症反应。然而，在50% PMMA–Si组中，组织与支架的整合更连续，囊壁更薄，表明二氧化硅的添加增强了生物相容性和组织整合。支架在植入前后重量未变，表明其在研究期间未发生可测量的降解。
在颅骨缺损模型中，显微CT分析显示，在整个12周的研究期内，50% PMMA–Si支架的新骨形成面积始终最高，在第12周达到63.34 ± 1.18%，显著优于纯PMMA支架（52.45 ± 1.32%）和空白对照组（43.25 ± 2.12%）。这表明二氧化硅的掺入显著加速了骨再生。组织学分析（H&E和MT染色）结果与显微CT一致，进一步证实了50% PMMA–Si组在促进新骨形成和胶原沉积方面的优越性。研究指出，硅（Si）通过激活细胞外信号调节激酶（ERK）等通路，上调I型胶原、骨形态发生蛋白-2（BMP-2）、Runt相关转录因子2（Runx-2）等成骨相关基因的表达，从而促进骨形成。
4. 结论
本研究成功开发了一种PMMA-二氧化硅杂化支架，旨在克服PMMA在骨组织工程中生物活性不足的局限。通过掺入二氧化硅，显著增强了支架的细胞相容性、细胞粘附、成骨分化能力以及in vivo骨再生效能。该支架结合了PMMA的力学稳定性和二氧化硅的生物活性，为骨再生治疗提供了一种有前景的材料。本研究的一个局限性在于支架材料不可降解，这可能限制其在需要材料完全被自体骨替代的应用场景中的使用。然而，其长期稳定性可为承重和重建应用提供持续的机械支撑和骨传导环境。
