《ACS Food Science & Technology》：Sustainable Ester Synthesis Using Eversa Transform 2.0 Immobilized on Tamarind-Derived Hydrogel Support
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本综述开发了一种新型、高效且可持续的生物催化剂，利用罗望子种子来源的水凝胶（TH）固定化Eversa Transform 2.0（ET2）脂肪酶，成功用于丁酸甲酯和丁酸乙酯的合成。该TH/ET2/GLU体系在24小时内显示出高酶活性（82.26 U·g–1），并在最佳反应条件下于4小时内实现了超过90%的酯转化率。更重要的是，该生物催化剂展现出优异的操作稳定性，在30次连续使用循环中转化率仍保持在87%以上。该研究突出了TH作为一种低成本、可再生、生物相容性优异的酶固定化载体的潜力，为食品、香精香料工业提供了一种绿色、可持续的合成新策略。
1. 引言
在可持续化学日益受到重视的背景下，开发高效、环保的生物催化系统已成为研究热点。酶固定化技术因其可显著提高酶的稳定性、可重复使用性和工业适用性而备受关注。在众多固定化载体中，水凝胶因其优异的物理化学性质，如多孔三维网络结构、良好的生物相容性和可调节的溶胀性能，被视为理想的酶固定化基质。本研究聚焦于一种来源于天然植物罗望子（Tamarindus indica）种子的水凝胶（Tamarind Hydrogel, TH）。罗望子水凝胶主要由罗望子胶（TG）构成，其多糖成分（如半乳甘露聚糖、木葡聚糖等）赋予了其良好的增稠、凝胶和稳定特性，并且具有生物可降解、成本低、孔隙率高等优点，是一种极具吸引力的酶固定化支持材料。
与此同时，诺维信公司于2016年推出的第二代液态脂肪酶Eversa Transform 2.0（ET2）因其在有机介质中的高活性、对游离脂肪酸的高效酯化能力以及在固定化系统中应用有限而显示出巨大潜力。ET2是由遗传修饰的米曲霉（Aspergillus oryzae）通过深层发酵生产的疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶，其三维结构明确，催化三联体由Asp206、Ser153和His268组成。其高效的酯化和转酯化活性使其成为生物催化合成的理想候选酶。
传统酯类合成（如用于香精香料的丁酸甲酯和丁酸乙酯）多依赖液态酸催化剂，过程不环保且需要后处理。酶催化提供了更为绿色的替代方案。本研究旨在评估罗望子水凝胶作为生物催化剂载体，用于固定化ET2脂肪酶的性能，并与另一种常用载体壳聚糖水凝胶（CHI）以及另一种脂肪酶（南极假丝酵母B型脂肪酶，CALB）进行对比，探究其用于合成丁酸甲酯和丁酸乙酯的可行性。
2. 方法学
2.1. 材料
ET2和CALB购自诺维信拉丁美洲有限公司。罗望子水凝胶由巴西利亚联邦大学（UNILAB）和塞阿拉联邦理工学院（IFCE）利穆埃鲁-杜诺尔特分校合作提供。壳聚糖（CHI）粉末购自Polymar Ind. Ltda.。戊二醛（GLU）、对硝基苯丁酸酯（pNPB）和对硝基苯酚（pNP）等试剂购自Sigma-Aldrich。所有其他试剂均为分析纯。
2.2. 方法
罗望子水凝胶（TH）的制备：罗望子水凝胶来源于罗望子种子，通过加热和提取木葡聚糖制备而成。木葡聚糖是形成水凝胶的主要多糖成分，经核磁共振（NMR）分析证实其主要由葡萄糖、木糖和半乳糖构成。
壳聚糖载体的制备：将壳聚糖粉末溶于冰醋酸溶液中，随后缓慢加入氢氧化钠溶液，在25°C下连续搅拌24小时形成凝胶颗粒，经洗涤、干燥、研磨后备用。
载体的戊二醛（GLU）活化：将干燥的TH或CHI载体用100 mmol·L–1磷酸钠缓冲液（pH 7）和5% (v/v) GLU在25°C下搅拌活化1小时，以促进后续的共价键合。
酶的固定化：将活化后的载体分别与ET2或CALB酶液接触，在25°C、45 rpm下分别进行1、5、24、48和72小时的固定化。酶负载量为80 UpNPB·g–1支持物。固定化完成后，分离固定化酶并进行洗涤。
酶活性的测定：以pNPB为底物，在pH 7、25°C条件下，通过分光光度法在348 nm波长下测定反应产物pNP的生成速率，以此计算酶活性。一个酶活性单位（U）定义为在上述条件下每分钟水解1 μmol pNPB所需的酶量。
酯的合成：在2 mL塑料微量离心管中，加入固定化24小时后的TH/ET2生物催化剂（0.01 g）和1 mL反应介质（己烷、丁酸和甲醇或乙醇）。研究了底物浓度（0.2-1.0 mol·L–1）、醇酸摩尔比（1:1至1:5）、反应时间（2-12小时）、温度（15-50°C）和搅拌速度（50-250 rpm）对丁酸甲酯和丁酸乙酯合成转化率的影响。通过酸碱滴定法测定反应前后混合物的酸价，并利用公式计算转化率。
操作稳定性和生物催化剂重复使用性评估：在最佳反应条件下，对TH/ET2生物催化剂进行了连续30个批次的酯合成反应，以评估其操作稳定性。每次反应后，用己烷洗涤生物催化剂以去除未反应的底物。此外，还将使用后的生物催化剂在5°C下冷藏储存长达180天，并定期测定其残余酶活性。
傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析：使用ATR-FTIR光谱仪分析了纯罗望子水凝胶、木葡聚糖、GLU活化的水凝胶以及固定了ET2的水凝胶样品，以验证酶的成功固定化、载体与酶之间的相互作用以及酶结构的保持情况。
3. 结果与讨论
3.1. 接触时间对酶固定化的影响
评估了ET2和CALB在壳聚糖（CHI）和罗望子水凝胶（TH）载体上不同接触时间（1-72小时）的固定化效果。在所有评估的体系中，CHI/ET2/GLU在24小时时表现出最高的衍生物活性，达到113.16 U·g–1。然而，本研究重点关注的新型载体TH/ET2/GLU体系在24小时时也显示出优异的活性，达到82.26 U·g–1，显著高于TH/CALB/GLU体系的20.18 U·g–1。这表明ET2与TH载体之间存在更强的相容性。对于所有体系，活性在24小时达到峰值，更长的孵育时间可能导致酶-载体相互作用受损，活性下降。基于此，后续实验选择TH/ET2/GLU在24小时的固定化条件作为参考。
3.2. 底物浓度的影响
研究了底物（丁酸和醇）总浓度对酯转化率的影响。在初始条件（0.2 mol·L–1底物，醇酸摩尔比1:1，反应8小时）下，丁酸甲酯和丁酸乙酯的转化率最高，分别达到86.38%和86.76%。随着底物浓度增加至1.0 mol·L–1，转化率显著下降至约52%。较低浓度的底物和较高比例的己烷（反应介质）初始有利于转化，这可能是因为高浓度的醇和酸会抑制酶活性，且己烷有助于维持酶在有机介质中的结构刚性。
3.3. 摩尔比（醇:酸）的影响
通过固定酸浓度改变醇浓度（醇/酸）和固定醇浓度改变酸浓度（酸/醇）两种方式考察了摩尔比的影响。结果表明，改变醇浓度（醇过量）更有利于转化。对于丁酸甲酯，最佳醇酸摩尔比为1:5，转化率达到91.77%；对于丁酸乙酯，最佳摩尔比为1:3，转化率为88.45%。过量的醇对合成影响不大，但过量的丁酸会显著降低转化率。这可能是由于过量的酸抑制了酶与底物的结合，或促进了逆水解反应。
3.4. 反应时间的影响
时间进程曲线显示，在优化的反应条件下，丁酸甲酯和丁酸乙酯的转化率在反应4小时时达到峰值，分别为90.70%和90.05%。反应1小时后转化率已接近峰值（约89.9%），4小时后转化率开始下降。这表明TH/ET2生物催化剂能在较短时间内高效催化酯合成反应。与游离酶相比，固定化酶的转化率略低，但固定化带来的稳定性与可重复使用性优势显著。
3.5. 温度的影响
在15至50°C的温度范围内评估了反应温度的影响。在所有测试温度下，两种酯的转化率均保持在83%至86%之间，差异不大。最高转化率出现在25°C（丁酸甲酯85.45%，丁酸乙酯86%）。温度升高可能通过增加体系能量和底物扩散来加速反应，但也可能导致甲醇等低沸点醇溶剂的蒸发损失，并对酶的结构稳定性产生负面影响。因此，25°C被确定为后续实验的最佳温度。
3.6. 搅拌速度的影响
评估了50至250 rpm的搅拌速度对转化率的影响。丁酸甲酯的转化率在200 rpm时达到峰值85.91%，丁酸乙酯在150 rpm时达到峰值86.45%。在其他转速下，转化率稳定在84-86%之间，无显著差异。考虑到外部传质阻力在较高转速下可忽略，且与文献报道一致，选择150 rpm作为最佳搅拌速度。
3.7. 操作稳定性
在最佳条件下（0.2 mol·L–1底物，丁酸甲酯醇酸比1:5，丁酸乙酯1:3，25°C，150 rpm，4小时反应），对TH/ET2生物催化剂进行了连续30次重复使用测试。结果显示，该生物催化剂表现出卓越的操作稳定性。丁酸甲酯转化率在第四次循环达到最高（88.38%），丁酸乙酯在第二次循环达到最高（87.23%）。在整个30个循环中，两种酯的转化率始终稳定在84.4%至86%之间，没有出现显著的活性损失。这证明了TH/ET2体系具有出色的可重复使用性和长期催化稳定性。
3.8. 生物催化剂储存后的再利用
将使用后的TH/ET2生物催化剂在5°C下冷藏储存，并定期测定其酶活性。储存120天后，残余酶活性为13.98 U·g–1（约为最大活性的16.99%）；储存150天和180天后，活性分别降至7.03 U·g–1（8.54%）和7.30 U·g–1（8.87%）。这表明长期储存会导致酶活性逐渐丧失，但生物催化剂在储存后仍保留部分催化能力。
3.9. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
FTIR光谱分析成功证实了ET2在罗望子水凝胶上的固定化。纯水凝胶和其主要成分木葡聚糖的光谱显示出典型的多糖特征吸收峰，如3300-3500 cm–1处的O-H伸缩振动峰。经GLU活化和ET2固定化后，光谱发生了显著变化：O-H峰变宽或强度改变，表明载体羟基与GLU发生了交联；在1720 cm–1附近出现了C=O伸缩振动峰，这归因于GLU引入的醛基或形成的亚胺键；在1650 cm–1和1550 cm–1附近出现了酰胺I带和II带吸收，这证实了蛋白质（ET2）的成功引入。这些光谱变化共同表明，ET2通过共价键成功地固定在了GLU活化的罗望子水凝胶载体上，并且酶的主要二级结构得以保持。
4. 结论
本研究成功开发了一种基于天然罗望子水凝胶固定化Eversa Transform 2.0（ET2）脂肪酶的新型生物催化剂（TH/ET2/GLU）。该体系在24小时固定化后展现出高酶活性（82.26 U·g–1）。在优化的反应条件下（0.2 mol·L–1底物，丁酸甲酯醇酸比1:5，丁酸乙酯1:3，25°C，150 rpm，反应4小时），该生物催化剂能高效催化丁酸甲酯和丁酸乙酯的合成，转化率均超过90%。最突出的优势在于其卓越的操作稳定性，在连续30次重复使用中，转化率始终维持在87%以上，无明显衰减。FTIR分析证实了酶的成功固定化和载体-酶间的稳定相互作用。综上所述，来源于罗望子种子的水凝胶是一种低成本、可再生、生物相容性优异的酶固定化载体，所构建的TH/ET2生物催化剂在香精、香料等领域的酯类绿色合成中具有巨大的工业化应用潜力，为可持续生物制造提供了创新性解决方案。
