《Antioxidants》：Kynurenic Acid/GPR35 Signaling Protects the Infarcted Heart by Suppressing Macrophage mtDNA-Triggered cGAS-STING Activation
Yuyuan Mao,
Jiao Jiao,
Xinyu Zhu,
Wenhu Liu,
Shujie He,
Nana Li,
Haoyi Yang,
Jingyong Li,
Tingting Tang and
Xiang Cheng
+ 1 author
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这篇原创性研究论文（非综述）揭示了犬尿喹啉酸（KynA）通过其受体GPR35（G protein-coupled receptor 35），在心肌梗死（MI）后发挥心脏保护作用的核心机制。研究发现，KynA/GPR35信号轴能抑制巨噬细胞向促炎表型极化，通过阻止电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）寡聚化来减少线粒体DNA（mtDNA）泄漏，进而下调cGAS（cyclic GMP–AMP synthase）/STING（stimulator of interferon genes）/TBK1（TANK-binding kinase 1）/IκBα（NF-κB inhibitor α）/NF-κB P65亚基信号通路，减轻心脏炎症、改善心室重构和心功能。这项工作为心肌梗死后的免疫调节治疗提供了新的潜在靶点。
引言：心肌梗死后的炎症挑战与新的调节者
心肌梗死（MI）是全球发病和死亡的主要原因之一。除了最初的缺血损伤，随后的无菌性炎症反应对梗死愈合、心室重构和长期心功能具有关键影响。犬尿喹啉酸（Kynurenic acid, KynA）是色氨酸经由犬尿氨酸途径代谢产生的具有神经活性的代谢物，在免疫调节中扮演着重要角色，但其在心肌梗死后的具体作用尚不明确。G蛋白偶联受体35（G protein-coupled receptor 35, GPR35）已被确定为KynA的功能性受体。巨噬细胞是免疫系统的关键组成部分，在心肌梗死后的心脏修复中起着举足轻重的作用，其功能受微环境精细调控。基于此，本研究提出假设：KynA/GPR35轴可能通过调节巨噬细胞功能来影响心肌梗死进程。
KynA促进心肌梗死后的心脏修复
为探究KynA对心功能的影响，研究团队建立了小鼠永久性左前降支（LAD）冠状动脉结扎的心肌梗死模型，并在术后连续7天腹腔注射KynA。术后第28天的超声心动图评估显示，KynA治疗显著改善了左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS），同时降低了左心室舒张末期内径（LVEDD）和左心室收缩末期内径（LVESD）。此外，KynA还降低了心脏重量/体重比（HW/BW）和肺重量/体重比（LW/BW）。通过Masson三色染色评估心脏结构，发现KynA显著减小了梗死瘢痕面积，并减轻了间质纤维化程度。这些结果综合表明，KynA能够促进心肌梗死后的心脏修复，减轻不良重构，并保护心脏功能。
KynA抑制心肌梗死后的促炎巨噬细胞募集
鉴于KynA是已知的免疫调节剂，研究首先关注了其对心肌梗死心脏中巨噬细胞的影响。流式细胞术分析显示，KynA处理显著降低了心脏中巨噬细胞的总比例。亚群分析进一步表明，促炎巨噬细胞（CD86+）的比例明显下降，而抗炎巨噬细胞（CD86-）的比例相对增加。绝对定量分析证实，总巨噬细胞数量的减少完全由促炎巨噬细胞亚群的减少所驱动。免疫荧光染色也验证了巨噬细胞，特别是表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的促炎巨噬细胞在心脏中的减少。与此一致，KynA治疗显著降低了心脏中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。
为了探究KynA是否影响单核细胞向心肌的浸润，研究人员进行了适应性转移实验。将用膜荧光染料PKH26标记的骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）静脉注射给心肌梗死小鼠，结果发现KynA组小鼠梗死心脏中PKH26阳性巨噬细胞的累积显著减少。同时，KynA下调了梗死心脏中与巨噬细胞相关的关键趋化因子，包括CXC趋化因子配体10（Cxcl10）、CC趋化因子配体2（Ccl2）、CC趋化因子配体3（Ccl3）的mRNA表达，并降低了CCL2蛋白的水平。这些数据表明，KynA选择性地抑制了趋化因子驱动的促炎巨噬细胞向损伤心肌的募集。
巨噬细胞耗竭消除了KynA的保护作用
为了进一步验证巨噬细胞是否是KynA发挥心脏保护作用的必要介质，研究使用氯膦酸盐脂质体腹腔注射来系统性耗竭巨噬细胞。在成功耗竭巨噬细胞的情况下，KynA对心功能的改善作用（提高LVEF、LVFS，降低LVEDD、LVESD）被完全消除。同样，在巨噬细胞耗竭条件下，KynA治疗组与对照组之间的HW/BW、LW/BW比值、瘢痕大小和纤维化程度均无显著差异。这些结果确证，巨噬细胞是KynA发挥心脏保护作用不可或缺的效应细胞。
KynA/GPR35信号通过改善线粒体功能抑制促炎巨噬细胞极化
接下来，研究在细胞水平探究KynA对巨噬细胞极化的直接调控作用。用脂多糖（LPS）和干扰素-γ（IFN-γ）刺激BMDMs向促炎表型极化，同时加入KynA。结果显示，KynA处理显著下调了诱导型一氧化氮合酶基因（Nos2）的表达，并降低了CD86+促炎巨噬细胞的比例。同时，KynA降低了细胞总活性氧（ROS）和线粒体活性氧（mtROS）水平，增强了线粒体膜电位（MMP）。免疫荧光成像也验证了这些发现。相应地，促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的转录和分泌均被KynA显著抑制。这表明KynA能够抑制巨噬细胞的促炎表型，并保护其线粒体功能。
KynA可通过多种受体发挥作用，包括GPR35、离子型谷氨酸受体和芳香烃受体（AhR）。通过使用AhR抑制剂CH223191和GPR35靶向的小干扰RNA（siRNA）进行验证，研究发现，阻断AhR并未改变KynA的作用，而敲低GPR35则完全逆转了KynA对促炎巨噬细胞极化的抑制作用。具体表现为：恢复了Nos2表达和CD86+细胞比例，增加了ROS和mtROS水平并降低了MMP，同时提升了促炎细胞因子水平。这些发现证明，KynA的抗炎作用主要是由GPR35介导的。
KynA/GPR35信号通过阻止mtDNA泄漏抑制cGAS/STING通路激活
为了阐明KynA/GPR35下游的分子机制，研究对LPS/IFN-γ刺激的BMDMs进行了RNA测序（RNA-seq）。富集分析显示，KynA处理显著抑制了与细胞因子产生、白细胞迁移、以及胞质DNA感知和核因子κB（NF-κB）通路相关的基因。具体来说，KynA降低了环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（Cgas）、干扰素基因刺激蛋白（Sting1）以及多个炎症介质（Il1b, Tnf, Il6）的表达。蛋白质免疫印迹结果证实，KynA处理降低了cGAS和STING的蛋白丰度，并减少了TANK结合激酶1（TBK1）、IκBα和NF-κB P65亚基（P65）的磷酸化水平。
鉴于线粒体损伤是触发胞质mtDNA释放和随后cGAS激活的已知因素，研究评估了mtDNA泄漏情况。KynA显著降低了胞质中mtDNA的丰度，包括细胞色素c氧化酶II（Cox2）、ATP合酶膜亚基6（Atp6）和线粒体D环区（D-loop）序列的含量。此外，敲低GPR35显著逆转了KynA对线粒体功能障碍的抑制作用，表现为Cgas、Sting1表达的上调和mtDNA泄漏的增加。蛋白免疫印迹进一步证实，敲低GPR35逆转了KynA对cGAS、STING、TBK1、IκBα和P65激活的抑制作用。为了直接确定KynA是否通过抑制mtDNA释放发挥作用，研究用外源性mtDNA转染BMDMs。结果发现，添加mtDNA完全抵消了KynA的抑制作用，重新激活了cGAS/STING通路并恢复了促炎细胞因子的产生。这些数据表明，阻止mtDNA泄漏及其下游的cGAS/STING激活是KynA/GPR35轴发挥抗炎作用的关键机制。
KynA/GPR35通过抑制VDAC1寡聚化来阻止mtDNA泄漏
最后，研究探讨了KynA/GPR35轴阻止mtDNA泄漏的上游机制。电压依赖性阴离子通道1（VDAC1）是一种线粒体外膜蛋白，可在应激和炎症期间形成寡聚孔，促进mtDNA释放。蛋白免疫印迹分析显示，KynA处理显著降低了VDAC1的寡聚化，这与mtDNA释放的减少相关。重要的是，这种效应可被GPR35敲低所逆转。这些结果表明，KynA/GPR35轴通过限制VDAC1介导的mtDNA泄漏来抑制cGAS/STING通路的激活。
结论与展望
本研究揭示了KynA/GPR35信号轴是心肌梗死后心脏修复的重要调节器。该通路通过抑制巨噬细胞的浸润和促炎极化，保护线粒体完整性，并减轻VDAC1依赖的mtDNA泄漏，从而阻止cGAS/STING/TBK1/IκBα/P65信号级联的异常激活，减少炎症细胞因子产生，最终改善心室重构和功能。这些发现将KynA/GPR35轴生物学与巨噬细胞线粒体功能联系起来，扩展了当前认知，并为急性心肌梗死的治疗确定了一个新的潜在治疗靶点。尽管本研究聚焦于cGAS/STING通路，但mtDNA也能激活其他危险感知通路，如Toll样受体9（TLR9）和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎性体，因此KynA/GPR35轴可能具有更广泛的免疫调节作用，有待未来研究进一步探索。
