《Cells》：Induced Pluripotent Stem Cells as a Tool to Decipher the Normal and Abnormal Development of the Esophagus and Trachea from Normal Morphogenesis to Esophageal Atresia, Tracheomalacia, and Laryngo–Tracheal Clefts
Yuxuan Zhang,
Anu David,
Alireza Nemati and
Christophe Faure
编辑推荐：
本文综述了利用诱导多能干细胞（iPSC）研究前肠中食管与气管分化发育机制的价值。文章系统阐述了由BMP、Wnt/β-catenin、Sonic Hedgehog和FGF等信号通路介导的内胚层与中胚层间互作如何调控背腹侧模式化与谱系特化，其失调可导致气管食管瘘（EA/TEF）、气管软化等多种先天性畸形。iPSC分化模型为在体外重现这些过程、理解疾病机理提供了强大平台。
1. 引言
在哺乳动物胚胎发生的早期，食管和气管分别从前肠的背侧和腹侧发育而来。背侧的食管上皮表达转录因子SOX2，最终分化为复层鳞状上皮；腹侧的气管上皮则表达另一个关键转录因子NKX2.1，形成具有呼吸功能的多细胞类型上皮。这一分化过程始于人类胚胎发育的第4-5周，涉及前后轴确立后的背腹侧模式化。气管原基的出芽及与食管的分离，受到骨形态发生蛋白（BMP）、Wnt、刺猬（Hedgehog）和成纤维细胞生长因子（FGF）等多种信号通路复杂协调的诱导与调控。这些信号分子在前肠内胚层与中胚层的双向通讯中扮演关键角色。
这一精确调控的互作一旦失调，可能导致新生儿食管和气管畸形，如先天性气管软化、喉-气管食管裂以及伴或不伴气管食管瘘（EA/TEF）的各类食管闭锁，发病率约为1/3000。然而，其潜在机制尚不完全清楚。因此，需要一份完整的时空图谱来描述中胚层与内胚层之间的这些分子事件。动物模型研究提供了宝贵信息，而在过去十年中，干细胞，尤其是诱导多能干细胞（iPSC），已被广泛用于理解胚胎发育和创建疾病模型。iPSC的定向分化可用于生成食管样和呼吸样上皮及间充质，从而监测包括前肠内胚层和中胚层发育在内的不同关键发育阶段。
2. 前肠的区室化、分离及器官特异性上皮与间充质的成熟
原条建立后，中内胚层分化为侧板中胚层和定形内胚层谱系，形成肠管。至人类胚胎发育第3周，前后轴确立，前肠背腹侧模式化启动。未来气管原基形成的腹侧是呼吸命运的所在地，而食管命运位于前肠的背侧。在第4周，气管原基出现，启动食管与气管的物理分离。此时，背侧内胚层细胞表达SOX2，腹侧表达NKX2.1。边界处的细胞共表达SOX2、NKX2.1和ISL1。为了分离成两个管道，这些边界内胚层细胞在周围间充质产生的压缩力作用下收缩、融合。
前肠区室化完成后，食管和气管的生长更为独立，食管延长更快。与气管分离后，食管上皮结构仅为单层柱状上皮细胞，此结构持续至第6周。随着P63和KRT5的表达，基底祖细胞启动并持续增殖，进而支持黏膜形成。这些细胞是基底角质形成细胞的直接前体。第8周可观察到将形成上皮中间层的基底上层细胞的特化，表现为非角化复层鳞状黏膜特性，表达KRT4和KRT13。到第10周，最终发育为完全分化的表层鳞状层。类似地，早期气管上皮在约第5周时也以单层柱状上皮为主要结构，但源于具有定向呼吸命运的腹侧前肠内胚层。从第6周开始，可观察到气管基底祖细胞表达P63、KRT5和NKX2.1。纤毛细胞的形态发生始于第7周，第12周时纤毛活跃形成。杯状细胞从第10周开始发育。随后，肺神经内分泌细胞、肺离子细胞和刷状细胞等也逐步特化。气管食管分离后，未成熟的气管上皮和食管上皮被各自的间充质包围，后者将分化为食管和气管的平滑肌，而不连续排列的软骨环成为气管的特有结构。
3. 参与气管-食管分离与发育的关键转录因子
3.1. SOX2
作为SOX家族成员，SOX2是胚胎发生早期祖细胞特化的关键转录因子。在前肠内胚层，由于BMP信号的抑制，SOX2表达主要局限于背侧区域。作为决定腹侧呼吸命运的NKX2.1的拮抗剂，其增强了背侧朝向食管的未来身份。SOX2已被证明可抑制背侧前肠中的经典WNT信号。Sox2的缺失或表达不足会导致食管命运的丧失和呼吸标志物的异常表达。SOX2在维持细胞命运和存活中起着并行作用，其异常下调会导致细胞凋亡和食管畸形，包括食管发育不全。在人类中，SOX2功能丧失已被证明会导致包括临床EA/TEF在内的无眼-食管-生殖器（AEG）综合征。因此，作为主要的背侧转录因子，SOX2通过与多种信号通路的协调来维持背侧-食管命运，并通过拮抗呼吸标志物NKX2.1来促进食管上皮的存活、增殖和分化。
3.2. NKX2.1
NKX2.1是参与前肠腹侧呼吸命运的关键转录因子。Wnt2/2b激活内胚层中的经典Wnt/β-catenin信号并诱导Nkx2.1的表达，这是决定这些细胞气管命运所必需的。上游转录因子Isl1对于前肠内胚层背腹侧中线Nkx2.1的激活是必要的。同时，Nkx2.1拮抗腹侧前肠内胚层中Sox2的表达以抑制背侧命运的发育。气管食管物理分离后，Nkx2.1是负责气管上皮建立和特化的主要转录因子。其表达促进了纤毛细胞和分泌细胞进一步特化所需基因的表达，同时抑制了肠样细胞诱导程序。此外，上皮中的NKX2.1表达对于调节间充质细胞的分化很重要。分离前，Nkx2.1的缺失或不足会导致腹侧区域建立失败及背腹侧前肠内胚层边界不清，直接导致EA/TEF的发生。分离后，Nkx2.1的下调会导致异常的上皮和间充质模式，进而导致瘘管形成。
3.3. FOXF1
作为Sonic Hedgehog（SHH）信号的下游靶标，FOXF1的表达首先在侧板中胚层中观察到，其对于围绕前肠内胚层的脏壁中胚层的建立至关重要。Foxf1精确控制小鼠胚胎间充质中WNT信号的活性。其在腹侧中胚层的高表达促进了其与呼吸域特异的腹侧内胚层的相互作用，并进一步支持肺芽的发育。因此，此阶段Foxf1表达的失调会导致小鼠前肠畸形，包括EA/TEF。在食管中，Foxf1对于间充质特化为平滑肌是必要的。在气管中，间充质特化为平滑肌和软骨环需要足够的Foxf1表达。FOXF1的适度下调足以通过影响间充质的发育导致前肠畸形。
4. 与前肠发育及气管食管特化相关的通路
4.1. BMP信号
骨形态发生蛋白（BMP）是TGF-β超家族成员。良好调控的BMP信号对于胚胎发生过程中的发育事件至关重要。Noggin对BMP信号的拮抗对于背侧前肠和食管的发育很重要，而配体Bmp4的激活对于腹侧前肠及后续气管的发育至关重要。多项体外研究证明，抑制BMP可改善分化细胞的食管命运，而激活BMP则导致呼吸命运。Bmp4从围绕前肠内胚层的间充质腹侧产生，导致气管食管分离和腹侧发育。激活BMP信号的Bmp4表达对于诱导上皮-间充质转化（EMT）的过程是必要的，该过程在前肠器官发生中产生大部分间充质。BMP信号的两个主要受体Bmpr1a和Bmpr1b的失活，会导致气管食管正常分离失败。相反，由Nog基因编码的BMP拮抗剂Noggin在脊索和背侧前肠中表达，通过诱导Sox2表达来抑制BMP信号并促进背侧和食管命运。
4.2. Wnt/β-Catenin信号
经典WNT通路涉及β-catenin向细胞核的转运。Wnt/β-catenin信号的激活在诱导胚胎发生过程中近端呼吸器官的发育和形态发生方面起着关键作用。内胚层中Wnt/β-catenin信号的早期激活对于诱导前肠内胚层腹侧的呼吸命运是必要的。然而，在背侧，β-catenin的存在激活WNT信号会导致食管中Nkx2.1的异常表达，并且配体Wnt5A通过下调Sox2表达来抑制食管命运。WNT信号还通过调节TBX4的表达在呼吸中胚层发育中发挥重要作用。背侧前肠间充质中的转录因子Barx1介导Sfrp1/2抑制WNT信号以诱导食管命运。
4.3. Sonic Hedgehog (SHH) 信号
SHH基因编码的信号分子在前肠的发育和区室化、气道形态发生和肺发育中至关重要。在气管和食管分离期间，Shh在腹侧前肠的气管憩室和背侧的细胞中均有表达，但背侧前肠内胚层中较高水平的Shh对于物理分离过程中间充质对上皮产生力量是必需的，并可改善食管命运。内胚层中的Shh对于诱导气道间充质细胞（包括表达Sox9的软骨祖细胞）的分化和增殖很重要。食管上皮中的Shh信号对于食管命运向相邻间充质的分布也起着决定作用。SHH信号的失调已被证明与前肠器官发育异常有关。
4.4. FGF信号
主要从间充质向上皮传递的FGF信号，对于诱导前肠腹侧形成呼吸命运是必需的。来自相邻心脏中胚层的FGF2以浓度依赖性方式促进人和小鼠定形内胚层的腹侧化，促进包括肺、气管和甲状腺在内的前肠的呼吸命运。Fgf10对于支持呼吸间充质的成熟也很重要。食管正常发育仍需要低水平的FGF信号，而来自周围食管间充质的过量FGF信号会诱导呼吸命运。Fgfr2是一个关键的FGF信号受体；其失活会导致消化和呼吸系统的多种畸形，包括气管软化和EA/TEF。
5. 信号网络协调介导的前肠器官特化过程中的中胚层与内胚层互作
5.1. 背腹侧模式化
在早期前肠发育过程中，不同信号通路之间的一系列相互作用导致了前肠腹侧和背侧区域的特化。这些相互作用诱导了中胚层和内胚层之间的串扰，以促进气管食管分离前的这种早期区域化。视黄酸（RA）诱导侧板中胚层的腹侧特化，并通过增强Shh表达影响相邻内胚层。腹侧间充质中由β-catenin激活介导的Wnt2/2b表达诱导了内胚层中Nkx2.1的表达，表明呼吸内胚层命运。同时，腹侧间充质来源的Bmp4响应的内胚层BMP受体抑制内胚层中Sox2的表达，以防止其拮抗Nkx2.1的表达和前肠内胚层中的背侧命运。
5.2. 气管食管分离
在上皮重塑过程中，BMP和WNT信号之间的协调对于通过激活Nkx2.1和抑制Sox2表达来维持腹侧的呼吸特性仍然很重要。值得注意的是，上皮的分离由Efnb2介导，其缺失会导致分离失败。Wnt2/2b刺激腹侧内胚层对相邻中胚层分泌的Fgf10的反应，促进腹侧上皮增殖所需辅因子和受体的表达，同时抑制背侧命运。来自间充质的Fgf10刺激定向上皮增殖和向外生长，从而启动前肠腹侧的气管原基膨出。Shh通过调节Fgf10的表达位置来限制气管原基向外生长的区域，从而实现气管和食管的稳健分离。
5.3. 食管和气管的成熟
气管和食管分离后，复层鳞状上皮及其周围肌肉结构的特化和分化由信号通路的相互作用网络精确调节。小鼠食管上皮中Sox2的持续表达维持了食管特性，并且与低水平BMP和WNT信号之间的串扰一起，促进了食管的成熟。在食管间充质中，食管近端骨骼肌的特化始于平滑肌的分化。在气管发育过程中，这个相互作用的信号网络更为复杂，以诱导适当的上皮和间充质特化与增殖。经典Wnt/β-catenin信号保持活跃，以维持气管上皮祖细胞特性。此外，Wnt信号激活相邻间充质中的Fgf10，并接收来自Fgf10的反馈。Fgf10与Shh协调以使气管上皮和间充质区域化。Shh诱导间充质中Bmp4表达，以在此分化过程中增强Sox9表达和软骨命运。经典WNT信号改善了呼吸上皮转录因子的表达以诱导早期分化。Shh信号通过调节转录因子的空间表达负责这些上皮细胞的特化。
6. 用于理解前肠器官发育的iPSC模型
鉴于动物模型在人类胚胎发生研究和疾病发育研究中存在局限性，越来越多的科学家将人诱导多能干细胞（hiPSC）作为强大的体外工具。与动物模型相比，使用hiPSC可以更好地监测人类前肠器官发生和疾病发生过程中的谱系轨迹和转录程序。由于干细胞的多能状态，它们可以分化为器官样细胞。通过使用一套精确模拟体内调控的信号因子/分子来诱导分化，分化的细胞或类器官被用于研究器官发生和疾病发展过程中的分子信号事件。
6.1. 生成内胚层衍生物
使用干细胞生成食管和气管上皮的不同方法从定形内胚层诱导开始。肝细胞研究证明，定形内胚层由原条前部产生。hESC分化研究表明，同时激活BMP、WNT和FGF 1天，并结合NODAL信号激活，对于原条的生成至关重要，其中较低的BMP激活诱导了前原条的形成。生成定形内胚层后，下一步是生成前肠内胚层。从第4天到第5天抑制BMP和TGF-β，随后抑制WNT 1天，可以改善前肠内胚层的生成和食管特化。为了将前肠内胚层进一步分化为食管上皮，应从第6天到第16天抑制BMP信号和TGF-β通路，以使内胚层模式化为背侧（食管）命运。另一方面，将内胚层细胞分化为前肠内胚层后，激活WNT和BMP对于诱导呼吸命运是必要的。此外，联合激活FGF和RA处理可改善NKX2.1+气道祖细胞的生成。
6.2. 生成中胚层衍生物
多项研究更侧重于生成上皮而不是间充质来模拟疾病，从hPSC体外分化为食管和呼吸上皮，为模拟EA/TEF的发展提供了可行方法。然而，体外生成上皮无法复制前肠、食管和气管发育的完整过程，该过程受中胚层和内胚层之间协调的调节。因此，同样需要从干细胞生成食管样和气管样间充质，并理解前肠中胚层谱系发育过程中的分子事件。通常，从干细胞向中胚层谱系的分化始于中原条的生成。BRACHYURY是中原条的早期中胚层标志物，通过监测胚胎原肠胚形成过程中的激活和抑制来生成。激活BMP信号对于中胚层的生成和上皮-间充质转化的诱导至关重要。为了模拟原肠胚形成后的中胚层谱系发育和特化，诱导分化的中原条会导致HAND1+/FOXF1+侧板中胚层、脏壁中胚层以及进一步的器官特异性中胚层的生成。这些hPSC分化模型为理解前肠异常发育和气管-食管分离提供了平台。
7. 结论与未来展望
由于动物模型的局限性，在适当控制伦理问题、不可预测的突变和个体细胞系的克隆变异等关注点的前提下，干细胞分化将成为理解前肠发育的主要方法。基于先前的理解，已经开发并改进了不同的方案，以复制前肠内胚层和中胚层谱系的重要发育阶段。在EA/TEF患者来源的iPSC分化的前肠内胚层中，已证实SOX2与健康样本相比有所降低，并且在患者来源的食管上皮中观察到了NKX2.1呼吸命运。随着诱导中胚层谱系的方案，可以进行类似的比较，以了解健康和患者来源的前肠中胚层以及进一步的食管和气管间充质发育。未来，这些比较将提供一幅图谱，揭示诱导食管和气管命运过程中的失调，这可能与对多种信号通路的异常反应有关。遗传和表观遗传工具可用于健康来源的iPSC，以生成模拟致病环境的模型，这将有助于研究罕见畸形和开发新的临床疗法。此外，前肠发育过程中内胚层和中胚层之间的协调也应通过体外研究进行监测。因此，包含内胚层和中胚层的共培养模型将有助于更好地理解此阶段的分子机制。在分别生成早期内胚层和中胚层谱系后，可以创建共培养，随后用诱导器官特异性命运的生长因子/分子进行处理。食管或气管间充质-上皮培养物或三维类器官的生成将为理解前肠器官发生提供一个创新平台。结合细胞分选和微环境调节等策略，我们期望从这个平台生成更多特定的器官特异性间充质和上皮谱系，由于它们的相互作用，可以更好地模拟自然的器官发生。异常发育模型将有助于确定与多种前肠先天性疾病相关的基因，并且可以通过使用CRISPR/Cas技术纠正其表达来测试表型的校正。患者特异性iPSC分化细胞可用于人工仿生构建体以替换受损的组织或器官。此外，可以在患者特异性细胞上测试治疗方法，以提供更个性化的医疗方法。微流控平台也可以与iPSC分化相结合，以模拟体内观察到的分子梯度微环境，并生成同时包含具有不同器官特征的上皮和间充质谱系的更复杂系统。对这些复杂的分子信号级联的深入研究必将改善未来的治疗领域。
