《Cells》：Prime Editing Exhibits Limited Genome-Wide Off-Target Effects in Cellular and Embryonic Gene Editing
Jitan Zheng,
Mingdi Wu,
Xueyan Wang,
Zhenrui Zuo,
Chikai Zhou,
Erwei Zuo and
Yangqing Lu
编辑推荐：
本研究通过系统性比较PE2max、PE3max、PE4max和PE5max等四种先导编辑（PE）变体的安全谱，揭示了PE5max在提高靶向编辑效率的同时，具有显著改善的基因组特异性。其通过GOTI（基因组脱靶分析）未检测到可归因于sgRNA的全基因组SNV（单核苷酸变异），并且PEM-seq（引物延伸测序）数据显示其诱导的大片段缺失和染色体易位（CTX）远少于PE3max。该工作为先进基因编辑工具的综合安全性评估提供了框架，并支持PE5max在更安全治疗应用中的潜力。
1. 引言
先导编辑（Prime Editing, PE）是一种先进的基因编辑技术，能够在不断裂DNA双链的情况下实现精准的碱基替换、小片段插入或删除，甚至大片段修饰。该技术具有广阔的治疗前景，理论上可纠正约90%的已知遗传病，并在儿童交替性偏瘫（AHC）、苯丙酮尿症（PKU）等模型中得到验证。PE技术也应用于农业和畜牧业，如构建猪疾病模型和改良绵羊性状。在先导编辑系统的基础上，发展出了TwinPE、PASTE和Amplification Editing（AE）等衍生系统，进一步扩展了编辑范围和精度。尽管前景广阔，但PE系统，尤其是那些整合了DNA错配修复（MMR）抑制的系统，其潜在的脱靶活性和更广泛的基因组后果尚未得到充分表征。为了填补这一知识空白，本研究采用多种分析方法，对PE2max、PE3max、PE4max和PE5max四种PEmax系统进行了系统性评估，以全面比较其编辑效率、特异性和安全性。
2. 材料与方法
本研究构建了独立的表达质粒用于表达PEmax、epegRNA（工程化pegRNA）和nsgRNA（切口sgRNA）。所有质粒经测序验证。实验以HEK293T细胞系为主要模型，采用聚乙烯亚胺（PEI）进行质粒转染。转染后，通过流式细胞分选（FACS）分离共表达荧光标记的细胞。靶点区域的编辑效率通过集式PCR扩增和高通量测序进行评估。
为全面评估基因组结构变异，采用了PEM-seq（Primer-extension-mediated sequencing）技术，该方法可高灵敏度地检测大于100 bp的大片段缺失、大于20 bp的大片段插入以及染色体易位。同时，通过RNA-seq（转录组测序）分析PE系统对细胞转录组的全局影响。
在体编辑评估则在小鼠胚胎中进行。研究人员将体外转录（IVT）的PEmax mRNA、MLH1dn（显性失活MLH1）mRNA、epegRNA和nsgRNA混合，注射到C57BL/6×C57BL/6杂交受精卵的单细胞期胚胎中，并在囊胚期检测编辑效率。为了评估PE5max在体编辑的基因组脱靶效应，采用了GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection，通过双细胞胚胎注射进行全基因组脱靶分析）技术。该技术将编辑成分与iCre mRNA共注射到来源于Ai9（CAG-LoxP-Stop-LoxP-tdTomato）与C57BL/6杂交的两细胞胚胎中的一个卵裂球中。被编辑的细胞会表达tdTomato，从而可以在胚胎发育至E14.5天时，通过FACS分选tdTomato+（编辑）和tdTomato?（内部对照）细胞，并进行全基因组测序（WGS）。通过严格的多重变异识别器共识分析，高置信度地识别sgRNA依赖的体细胞变异。
3. 结果
3.1. PEmax系统在细胞中表现出高特异性且无sgRNA依赖性脱靶效应
研究人员在HEK293T细胞中比较了四种PE系统在三个内源性位点的编辑效率。结果表明，PE5max在所有位点均实现了最高的平均编辑效率（60.63%），且具有较低的indel频率（1.15%）。对潜在脱靶位点的深度测序分析显示，所有PE系统在预测的脱靶位点均未产生可检测的编辑事件。进一步评估epegRNA与基因组DNA的错配耐受性发现，当错配发生在间隔序列的中心位置时，PE3max和PE5max仍能维持相对较高的编辑活性，但这并未转化为显著的sgRNA依赖性脱靶编辑。
3.2. PE5max减轻了先导编辑诱导的结构变异
利用PEM-seq对基因组结构变异进行分析。结果显示，PE3max和PE5max均可诱导显著高于野生型对照的大片段缺失（分别为2.29%和0.78%）和插入（分别为1.53%和0.72%）。值得注意的是，PE5max诱导的大片段缺失和插入频率显著低于PE3max。在染色体易位方面，所有PE系统均检测到少量但显著的易位事件，但PE5max的易位频率低于PE2max和PE3max。此外，基因组易位位点图谱显示，PE5max的易位热点数少于PE3max。这些结果共同表明，PE5max相对于PE3max，显著降低了诱导结构变异的风险。
3.3. 先导编辑器避免RNA脱靶编辑但激活先天免疫反应
RNA-seq分析显示，与野生型对照相比，PE处理组细胞中的RNA SNV总数无显著增加，且所有组的突变谱均以A-to-G和T-to-C为主，与野生型模式一致，表明PE系统不会引起RNA脱靶编辑。然而，转录组扰动分析发现，所有PE系统均显著激活了与先天免疫和炎症相关的信号通路，特别是TNFα信号通过NF-κB的途径被强烈上调。这表明PE系统的递送会引发类似抗病毒先天免疫反应的转录重编程，这更可能是外源编辑组分递送引发的细胞应激反应，而非基因组编辑的直接后果。
3.4. 在GOTI分析中PE5max未产生可检测的脱靶效应
在小鼠胚胎中进行编辑评估，发现PE5max在两个测试位点均表现出最高（或在统计学上不显著的最强趋势）的编辑效率。基于此，研究人员利用GOTI技术对PE5max进行了全基因组脱靶评估。严格的生物信息学分析（三个变异识别器的共识）显示，在PE5max编辑的胚胎中，tdTomato+细胞相较于同胚胎内tdTomato?对照细胞，并未检测到额外的、可归因于sgRNA的全基因组SNV，其SNV数量与单独的iCre对照组相当，且这些变异是独立、非重复出现的。这表明在该检测的灵敏度范围内，PE5max不会在体内引发可检测的、sgRNA依赖性的全基因组脱靶SNV。
4. 讨论
本研究通过横向比较，证明PE5max相对于其他PEmax系统，在编辑效率和安全谱方面具有更优的综合表现。其通过抑制MMR提高了编辑效率，同时在细胞实验中诱导了比PE3max更少的结构变异，并在小鼠胚胎GOTI实验中没有检测到全基因组脱靶SNV增加。这表明PE5max具有改进的特异性，为未来更安全的治疗应用提供了潜力。
但研究也指出了几个重要的局限性和考量。首先，PE5max诱导的结构变异（如染色体易位）虽然频率低，但其临床风险仍需评估。其次，所有PE系统均引发了强烈的转录组应激反应，这主要与外源编辑组分的递送有关，在临床应用时需要监控。再者，本研究的评估主要在HEK293T细胞中进行，该细胞系存在MMR通路缺陷，且DNA修复机制不稳定，其结果向原代细胞、干细胞或疾病相关细胞类型的可推广性有待验证。此外，虽然实验中采用了短暂的MMR抑制，但其长期潜在风险（如微卫星不稳定性、突变率升高和癌症风险增加）在治疗应用中需谨慎考虑。最后，GOTI检测主要针对SNV，对大型结构变异或表观遗传改变的评估能力有限，且本研究评估的均为短期编辑结果，长期安全性和稳定性仍有待评估。
5. 结论
总体而言，本研究发现PE5max是一种高效的先导编辑器，其在细胞中诱导的结构变异少于PE3max，并在胚胎GOTI实验中未检测到基因组脱靶SNV的增加，显示出改进的安全性。然而，低频的结构变异、一致的转录组应激反应以及短暂MMR抑制的长期影响，仍需在非转化细胞和疾病相关模型中进行全面评估。未来通过优化引导RNA设计、编辑组件和递送策略，有望进一步提升其精准度和安全性，以推动其在临床和农业等领域的应用。
