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本文探讨了在模拟脑低灌注（缺氧/葡萄糖剥夺，OGD）条件下，两种β-淀粉样蛋白亚型（血管性荷兰突变体Aβ40E22Q与脑实质型Aβ42）对人脑微血管内皮细胞(HCMECs)功能的协同损害作用。研究揭示了缺氧和葡萄糖剥夺通过不同机制，分别选择性加剧了Aβ诱导的细胞凋亡/坏死、血脑屏障(BBB)破坏、促炎激活及血管生成障碍，为阿尔茨海默病(AD)与脑淀粉样血管病(CAA)合并低灌注时的血管病理机制提供了新的分子靶点。
缺氧和葡萄糖剥夺条件下AβQ22与Aβ42对脑内皮细胞功能的差异性影响
1. 引言
阿尔茨海默病(AD)是最常见的与年龄相关的痴呆症。其病理特征包括β-淀粉样蛋白(Aβ)斑块沉积、过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结、慢性神经炎症以及脑血管功能障碍。在普通老年人群及高达85-95%的AD患者中，普遍存在脑淀粉样血管病(CAA)，其特征是Aβ在脑血管壁及其周围沉积。CAA的后果包括局部缺血、脑低灌注(CH)、脑血流量(CBF)受损、血脑屏障(BBB)功能障碍、脑出血和微梗死。CAA沉积物主要由Aβ40亚型构成，倾向于积聚在脑血管壁内，而主要由Aβ42组成的斑块则多位于脑实质内。本研究使用的血管性家族性荷兰突变体Aβ40E22Q (AβQ22)含有一个第22位谷氨酸到谷氨酰胺的氨基酸替换，能加速该肽段的寡聚化。该突变体与早发性CAA密切相关，疾病进程最早可在30-40岁时开始，病理包括出血、中风和痴呆。与野生型(WT) Aβ40相比，AβQ22更具聚集倾向并对内皮细胞(ECs)产生更强烈的效应，因此在我们的体外实验中利用AβQ22是研究血管性Aβ特异性效应的重要工具。
目前广泛认识到，超过一半的痴呆病例是混合病理学痴呆，其中AD与脑血管病理是最常见的组合。越来越多的证据表明，脑血管功能障碍和CBF损伤导致的CH，很可能是AD早期发病机制的强烈影响因素，甚至发生在显著的淀粉样蛋白积累之前。慢性CH被认为是神经退行性变的驱动因素，它会促进脑氧和营养物质缺乏、增加氧化应激和神经炎症，导致神经元死亡和认知能力下降加速。AD患者和普通人群中都观察到CH与痴呆风险和认知能力下降加剧相关。因此，迫切需要更好地理解早期脑血管变化（如CH）对导致血管性认知障碍和痴呆(VCID)机制的作用。
大多数心血管疾病和风险因素已被发现会促进CH并增加痴呆和AD风险。衰老过程本身也会导致CH。高血压、缺血性中风等都会促进CH。有趣的是，CH和Aβ已被证明会产生类似的脑血管病理。尽管如此，CH和淀粉样蛋白病是否通过共同的分子机制来促进脑内皮功能障碍，以及它们是以相加还是协同的方式起作用，仍然未知。剖析由Aβ和CH共同激活并导致内皮病理的分子途径，对于确定可用于治疗AD、痴呆患者和老年人群中Aβ和CH共存的血管效应的新型分子靶点至关重要。
我们的实验室率先阐明了Aβ，特别是AβQ22和Aβ42，影响脑内皮细胞功能的机制。我们已证明，用人脑微血管内皮细胞(HCMECs)处理AβQ22和Aβ42会导致线粒体介导的细胞凋亡增加。此外，我们的研究还揭示了AβQ22和Aβ42处理会导致HCMEC屏障功能障碍，促进跨内皮电阻(TEER)损失和BBB调节蛋白的失调，并且这些Aβ亚型会降低HCMEC的血管生成和伤口愈合能力。同样，之前的文献表明，氧糖剥夺(OGD)，一种低灌注的体外模型，会促进类似的脑内皮细胞功能障碍，特别是促进细胞凋亡和坏死、屏障通透性以及血管生成/伤口愈合障碍。本研究旨在确定部分OGD是否会增强Aβ诱导的HCMEC死亡、屏障功能障碍和血管生成障碍的特定机制。本研究的另一个目标是了解OGD和Aβ组合导致的EC功能障碍是否具有Aβ亚型特异性。我们假设OGD将以相加的方式并通过激活共同的分子通路来加剧Aβ诱导的HCMEC凋亡、屏障损伤和血管生成缺陷，从而加速脑血管病理进展并增加痴呆风险。
2. 不同氧条件下AβQ22或Aβ42与葡萄糖剥夺差异性地影响HCMECs的凋亡和坏死
已有研究显示AβQ22和Aβ42会促进细胞凋亡和坏死标志物的增加，OGD也被报道可激活脑内皮细胞中类似的细胞死亡通路。Aβ积累和低灌注在AD和CAA大脑中同时发生，但两者结合是否会通过共同的细胞死亡机制加剧脑内皮细胞死亡尚不清楚。为此，我们在不同氧条件下，用AβQ22 (25 μM) 或 Aβ42(5 μM)、葡萄糖剥夺(GD)或两者组合处理HCMECs，测量了cleaved caspase-3、细胞凋亡和坏死水平。
结果显示，HCMECs暴露于AβQ22或Aβ42和GD均表现出cleaved caspase-3/7水平的加剧性升高，其中Aβ42+GD比AβQ22+GD更显著地增加了cleaved caspase-3/7水平。缺氧条件下也观察到类似的趋势。在测量DNA片段化（细胞凋亡终末阶段的标志）时发现，GD显著增强了AβQ22介导的细胞凋亡增加，但我们未在Aβ42+GD处理组中观察到这种增加，因为Aβ42本身已导致比AβQ22高得多的细胞凋亡水平。相反，Aβ42+GD挑战导致了坏死水平的显著增加。有趣的是，缺氧和GD联合处理(OGD)显著增加了Aβ42诱导的坏死，同时降低了由该肽段引起的细胞凋亡水平。在考虑缺氧-复氧(HR)条件时，HR本身显著增加了HCMEC的细胞凋亡和坏死水平。HR+AβQ22或HR+AβQ22+GD处理的ECs表现出最显著的坏死增加。
这些结果表明，在AβQ22存在下，葡萄糖的缺乏将HCMECs推向加剧的细胞凋亡，而氧气水平的降低和变化（如在HR期间）则驱动AβQ22暴露的HCMECs走向坏死。暴露于GD条件下的AβQ22和Aβ42处理的HCMECs均表现出cleaved caspase-3的加剧性增加，这在Aβ42处理中尤为明显。这种在24小时时的强烈caspase-3激活可能加速了细胞凋亡的终末阶段，使HCMEC的命运更快地转向继发性坏死，这在Aβ42+OGD处理的细胞中尤为明显。结果证实，即使在缺乏Aβ肽的情况下，操纵氧气水平（特别是在HR期间）也足以加剧脑内皮细胞的坏死性死亡。
3. HCMECs暴露于AβQ22和OGD可相加性地降低TEER和伤口愈合能力
我们之前已证明AβQ22和Aβ42会促进HCMEC屏障通透性，并且AβQ22会损害HCMEC伤口愈合。OGD也被证明会促进屏障功能障碍、通透性以及伤口愈合障碍。为了确定暴露于Aβ和/或OGD的HCMECs是否表现出内皮屏障通透性和伤口愈合障碍的相加性增加，我们利用了ECIS技术。
结果显示，正如预期，AβQ22和Aβ42均显著降低了HCMEC的TEER。暴露于AβQ22+OGD的HCMECs表现出TEER的相加性降低。类似地，当Aβ42与GD、缺氧或OGD结合使用时，HCMEC的TEER比单独用Aβ42处理时降低得更显著，但在后期时间点，Aβ42的加入对OGD诱导的TEER降低没有显著的相加效应，这可能是因为达到了TEER降低的最大极限效应，表明Aβ42+OGD条件下的屏障损伤主要由OGD驱动。
在伤口愈合实验中，AβQ22和Aβ42处理的HCMECs均表现出伤口愈合能力受损。HCMECs同时暴露于AβQ22+GD加剧了伤口愈合障碍，而暴露于AβQ22+OGD则表现出伤口愈合水平的相加性降低。有趣的是，Aβ42+OGD对HCMEC伤口愈合没有相加效应，但Aβ42+GD、Aβ42+OGD或单独OGD处理的HCMECs都表现出最严重的伤口愈合能力障碍。
4. HCMECs暴露于AβQ22或Aβ42与OGD可加剧BBB调节蛋白的表达变化
强有力的证据表明Aβ物种可通过破坏BBB调节蛋白（如紧密连接(TJs)）的表达和磷酸化状态来促进BBB通透性。暴露于OGD的脑内皮细胞也被报道会破坏屏障蛋白的表达和调节。因此，我们旨在了解HCMECs同时暴露于Aβ+OGD是否会相加性地加剧BBB相关蛋白的表达变化，以及这些变化是否具有Aβ亚型特异性并与观察到的TEER降低相关。为此，我们分析了用AβQ22或Aβ42、GD或两者组合在常氧或缺氧条件下处理24小时的HCMECs中zona occludin 1 (ZO1)、磷酸化claudin-5 (pClaudin5)和MMP2的蛋白表达。
ZO1是连接TJ蛋白和细胞骨架的关键锚定蛋白。缺氧处理的HCMECs表现出ZO1表达的显著增加，这可能是一种HIF-1介导的代偿机制，以在低氧下维持屏障完整性。然而，在缺氧或OGD条件下用AβQ22处理的HCMECs，与缺氧对照组相比，ZO1表达显著降低，AβQ22+OGD处理的细胞表现出ZO1表达的相加性降低。类似地，Aβ42+OGD处理的HCMECs与单独Aβ42或Aβ42+缺氧相比，ZO1表达降低，但显著性不及AβQ22+OGD组。Claudin-5是主要的TJ蛋白，其磷酸化与内皮屏障通透性增加直接相关。有趣的是，我们发现OGD挑战增加了pClaudin5的表达。此外，AβQ22+OGD或Aβ42+OGD处理的HCMECs与单独用肽段处理的细胞相比，表现出pClaudin5表达的相加性增加，其中Aβ42+OGD比AβQ22+OGD更显著地增加了pClaudin5水平。MMP2是一种降解细胞外基质的酶，是AD和CAA中BBB破坏和脑出血的已知参与者。我们的实验室和其他研究已证明，HCMECs暴露于Aβ物种（特别是AβQ22）会增加MMP2的表达和活性，OGD暴露的HCMECs也有类似效应。处理24小时后，在GD和OGD条件下用AβQ22或Aβ42处理的HCMECs表现出MMP2蛋白表达的加剧性增加，其中Aβ42+OGD处理的细胞MMP2水平增加最显著。在早期时间点（6小时）也观察到了类似的趋势。总体而言，HCMECs暴露于Aβ+OGD所诱导的ZO1损失加剧、claudin-5磷酸化和MMP2上调表明，Aβ和OGD以相加的方式作用于相同的蛋白介质，从而加剧BBB功能的丧失。
5. AβQ22或Aβ42与OGD组合差异性地加剧脑血管炎症调节因子和单核细胞跨内皮外渗
细胞间粘附分子1 (ICAM1)是免疫细胞从脑血管腔外渗进入脑实质的关键参与者，这些免疫细胞释放促炎因子并驱动AD和CH相关疾病中的神经炎症。此外，包括IL-6、IL-8和IFN-γ在内的促炎细胞因子已被证明可诱导BBB通透性。为了了解HCMECs同时暴露于Aβ物种和OGD是否会加剧促炎介质的表达，我们测量了用AβQ22或Aβ42、GD或两者组合在常氧或缺氧条件下处理24小时的HCMECs中ICAM1蛋白的表达。
虽然GD单独导致了ICAM表达的增加，但AβQ22+GD以及AβQ22+OGD诱导了ICAM1表达的加剧性增加，这种过度表达似乎主要由GD驱动，而非缺氧。与AβQ22不同，Aβ42挑战对GD介导的ICAM1过度表达没有相加效应。
此外，我们旨在了解HCMECs同时暴露于Aβ物种和OGD是否会相加性地促进促炎细胞因子的分泌。为此，我们使用了多重细胞因子阵列(MSD)。HCMECs用AβQ22或Aβ42、GD或两者组合在常氧或缺氧条件下处理6小时，然后收集培养基。AβQ22和Aβ42差异性地影响了某些促炎细胞因子的表达。用AβQ22+OGD处理HCMECs导致IL6分泌的相加性增加。用AβQ22+OGD处理的HCMECs也表现出IL8表达的显著增加。相反，用Aβ42和GD或OGD处理HCMECs导致IFN-γ分泌水平的可比性增强。此外，用Aβ42+GD或Aβ42+OGD处理HCMECs导致IL12p70的显著增加。
为了了解Aβ+OGD的联合挑战是否也影响了微血管炎症激活的功能性测量，我们进行了单核细胞跨内皮外渗实验。HCMECs形成单层后，用AβQ22或Aβ42、OGD或两者组合处理24小时。处理后，允许荧光标记的人单核细胞穿过EC屏障迁移6小时，并测定外渗的单核细胞数量。用AβQ22或Aβ42和OGD组合处理HCMECs导致单核细胞穿过EC单层迁移的显著加剧，其中暴露于AβQ22+OGD的HCMECs与对照组和每个单独处理条件相比，表现出最显著的单核细胞迁移增加。
总之，HCMECs暴露于Aβ+OGD导致的ICAM1和促炎细胞因子表达的增加，揭示了Aβ+OGD协同加剧EC激活的特定分子机制，这导致单核细胞穿过HCMEC屏障的迁移增加，从而为理解在血管淀粉样变性和低灌注共存的条件下促进HCMEC屏障通透性和微血管炎症激活的途径提供了见解。
6. Aβ和OGD相加性地降低HCMECs的血管生成能力
脑血管生成是重要的稳态过程，允许内皮细胞形成新血管以维持适当的脑血流量水平，特别是在灌注不良或微血管损伤的情况下。我们的实验室已证明，用低剂量的AβQ22和Aβ42挑战HCMECs会损害血管生成，特别是减少血管分支。先前证据表明，暴露于OGD的ECs表现出类似的血管生成障碍。因此，我们试图阐明HCMECs暴露于Aβ与OGD组合是否会加剧血管生成障碍，以及这两种挑战是否通过共同的分子机制产生这种功能障碍。HCMECs用AβQ22或Aβ42(1 μM)、GD或两者组合处理，并在常氧或缺氧下通过血管生成实验监测6小时后的血管形成能力。
所有处理条件下的HCMECs与对照组相比，血管分支数量均显著减少，表明血管生成减少。然而，暴露于Aβ肽段+OGD的HCMECs与单独暴露于处理的细胞相比，表现出最剧烈的血管分支抑制。
由于HCMECs同时暴露于Aβ+OGD相加性地降低了血管生成能力，我们随后旨在确定我们是否在关键血管生成介质的蛋白表达中观察到了类似的变化。HCMECs在相同6小时时间点用Aβ肽段、GD或两者组合在常氧或缺氧条件下处理。评估了磷酸化血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2) Y1175 (pVEGFR2)的蛋白表达。正如预期，缺氧暴露的HCMECs与对照组相比，pVEGFR2表达显著增加。当HCMECs暴露于缺氧+AβQ22或Aβ42时，这种缺氧诱导的活性pVEGFR2增加被阻止。暴露于Aβ42+OGD的HCMECs与单独用Aβ42处理的细胞相比，pVEGFR2降低，而用AβQ22+OGD处理的细胞与缺氧和常氧对照组相比表现出最显著的降低。相应地，我们发现用AβQ22+OGD处理的HCMECs与缺氧和常氧对照组相比，细胞内VEGF-A蛋白丰度显著降低。由于VEGF-A通常由血管ECs分泌，我们还测量了6小时和24小时后HCMEC条件培养基中的可溶性VEGF-A (sVEGF-A)水平。在短期（6小时）和长期（24小时）时间点，当HCMECs暴露于缺氧时，都观察到sVEGF-A水平的显著增加。有趣的是，暴露于AβQ22的HCMECs在6小时和24小时时与对照组相比，sVEGF-A释放显著增加。具体来说，在6小时时，在缺氧条件下用AβQ22处理的HCMECs显示出最高的sVEGF-A水平，而Aβ42处理对sVEGF-A表达没有影响。在24小时时间点，当细胞暴露于Aβ42+OGD时，观察到sVEGF-A水平的相加性增加，当HCMECs用AβQ22+OGD处理时也观察到相同的相加性增加。总体而言，这些结果表明，细胞释放sVEGF-A的增加可能是对缺氧/OGD条件的一种代偿机制。然而，这并没有导致功能性VEGFR2的激活，特别是在Aβ和OGD联合治疗中。
HIF1α是缺氧反应的主要调节因子，也是促进促血管生成基因（如VEGF）表达的转录因子。因此，我们还测量了用AβQ22或Aβ42、GD或组合在常氧或缺氧条件下处理6小时的HCMECs中HIF1α蛋白的表达。正如预期，HCMECs单独暴露于缺氧导致HIF1α表达显著增加。在缺氧条件下用AβQ22处理HCMECs显著增强了HIF1α的增加，但AβQ22+OGD处理没有观察到进一步增加。用Aβ42+OGD处理的HCMECs与常氧和缺氧对照组相比，表现出最显著的HIF1α蛋白表达上调，这似乎主要由OGD处理驱动。综上所述，这些数据表明Aβ增强了缺氧/OGD反应，加剧了HIF1α上调和sVEGF-A分泌，但这些促血管生成因子在没有促进血管生成信号的情况下积累，因为我们在Aβ+OGD挑战后观察到pVEGFR2表达和血管分支的相加性减少。
7. 讨论与结论
本研究旨在确定HCMECs暴露于Aβ和OGD是否会导致细胞凋亡和坏死性细胞死亡机制、屏障通透性和血管生成衰竭的常见分子介质的相加性增加。此外，我们旨在了解两种已知对脑内皮细胞具有促凋亡作用并促进BBB通透性的不同Aβ物种（AβQ22和Aβ42）在缺氧、GD和OGD条件下是否促进类似或差异性的HCMEC功能障碍机制。
在细胞死亡方面，研究证实，在AβQ22存在下，葡萄糖的缺乏将HCMECs推向加剧的细胞凋亡，而氧气水平的降低和变化则驱动AβQ22暴露的HCMECs走向坏死。暴露于GD条件下的AβQ22和Aβ42处理的HCMECs均表现出cleaved caspase-3的加剧性增加。OGD和HR条件特别加剧了Aβ42介导的坏死。这些发现强调了氧气和葡萄糖可用性在决定Aβ暴露下脑内皮细胞命运中的不同作用。
在屏障功能方面，本研究提供了新的证据，表明HCMECs同时暴露于AβQ22+OGD会导致TEER持续相加性降低，反映了最具通透性的HCMEC屏障。对于Aβ42+OGD，这种相加效应出现在早期而非晚期时间点。分子机制上，缺氧诱导了ZO1的上调，这可能是维持屏障完整性的代偿机制。然而，当HCMECs受到AβQ22或Aβ42与OGD联合挑战时，ZO1表达显著降低。此外，Aβ+OGD处理的细
