《Cells》：TRPA1 Expressed by Hepatocytes and Liver Macrophages Does Not Mediate Inflammatory Infiltration and Steatosis in a Mouse Model of Chronic Alcohol-Induced Liver Injury
Dorottya Luca Fehér,
Ammar Al-Omari,
Zoltán Sándor,
Dániel Hegedüs,
Balázs Gaszner,
Veronika Szombati,
András Fincsur and
Viktória Kormos
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本文通过RNAscope ISH技术首次证实TRPA1在肝细胞与肝脏巨噬细胞中的表达，并证明其可被酒精代谢物乙醛激活。然而，在为期三个月的慢性酒精摄入小鼠模型中，研究发现肝脏的脂肪变性和炎性浸润并不依赖于TRPA1信号通路，提示TRPA1并非早期酒精性肝病（ALD）病理过程的核心介质，其潜在作用可能在于后期纤维化阶段，为未来研究提供了新方向。
引言
过度饮酒是西方国家肝病的主要诱因。酒精主要在肝脏中代谢，其分解过程中产生的有毒中间产物，如乙醛，是酒精性肝病（ALD）发病机制中的关键介质，可通过抑制脂质代谢、加剧炎症和触发纤维化等多种途径损害肝脏。ALD的病理谱涵盖酒精性脂肪肝（AFL）、酒精性脂肪性肝炎（ASH）、纤维化、肝硬化，直至肝细胞癌（HCC）。瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）是一种钙渗透性非选择性阳离子通道，可被多种有害刺激激活，并参与调控炎症、纤维化等过程。先前文献提示，酒精及其代谢物乙醛是TRPA1的激活剂。本研究假设TRPA1在肝脏中表达，可被酒精代谢物激活，并在酒精性肝损伤中发挥作用。为此，研究设定了三个主要目标：利用RNAscope原位杂交结合免疫荧光技术确认小鼠肝脏中TRPA1的表达；通过钙成像技术证明乙醛等人源TRPA1的激活功能；并在TRPA1基因敲除（KO）小鼠的慢性酒精摄入模型中探究TRPA1在ALD中的作用。
材料与方法
研究设计分为三个部分。首先，在C57BL6/J小鼠肝脏样本中，通过RNAscope原位杂交结合离子化钙结合衔接分子1（IBA1）、CD68和精氨酸酶-1的免疫染色，检测Trpa1mRNA的表达。其次，在过表达人源TRPA1的中国仓鼠卵巢细胞（CHO）系中，通过钙成像技术检测酒精及其代谢物乙醛、乙酸对TRPA1的激活能力。最后，在为期三个月的慢性连续饮用20%酒精水溶液的小鼠模型中，比较野生型（WT）和Trpa1KO小鼠的肝脏损伤情况，评估血浆肝酶水平，并对经高碘酸希夫-苏木精（PAS-H）染色的肝脏切片进行门脉及界面炎性浸润、脂肪变性的形态计量学分析。
实验中，使用来自Jackson实验室的C57BL6/J小鼠检测Trpa1表达。慢性酒精模型使用的是由意大利佛罗伦萨大学提供的Trpa1WT与KO小鼠繁殖对。该KO模型通过靶向敲除关键外显子使TRPA1通道蛋白功能完全丧失，但仍可检测到Trpa1mRNA的转录。动物饲养于标准化环境，酒精组小鼠的唯一液体来源为20%乙醇溶液，实验持续3个月。实验结束后，采集血浆检测天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）水平，并取肝左叶进行组织固定、包埋、切片及染色。肝脏损伤评分系统基于门脉炎性浸润灶数量、界面炎性浸润灶数量以及脂肪变性累及肝切面的百分比制定。所有统计学分析使用Statistica 8.0软件进行，数据以平均值±标准误表示，采用双因素方差分析（ANOVA）及事后检验，钙成像数据采用Welch t检验。
结果
3.1. Trpa1mRNA在小鼠肝细胞和肝脏巨噬细胞中表达
通过高灵敏度的RNAscope ISH结合免疫组化技术，研究证实了Trpa1mRNA在小鼠肝脏中的表达。精氨酸酶-1阳性的肝细胞呈现Trpa1阳性信号。同时，利用CD68和IBA1免疫荧光共标技术确认，Trpa1mRNA也存在于肝脏巨噬细胞中。结果显示，Trpa1mRNA信号点分布相对弥散，并未在门静脉周围或中央静脉周围区域富集。
3.2. 乙醛能够激活人源TRPA1
钙成像实验结果表明，在1-10 mM浓度范围内，乙醇和乙酸均不能激活人源TRPA1受体。低浓度的乙醛同样无效，但10 mM的乙醛能够引起缓慢而微弱的TRPA1激活，其反应强度约为阳性对照物芥子油（100 μM）反应的三分之一。对10 mM乙醛引起的Fura-2信号峰值和曲线下面积（AUC）的统计分析均显示，TRPA1阳性细胞与TRPA1阴性对照细胞之间存在显著差异。
3.3. 酒精诱导的小鼠炎性浸润和脂肪变性由不依赖TRPA1的机制介导
在为期三个月的慢性酒精暴露模型中，研究评估了WT和Trpa1KO小鼠的肝脏损伤。在肝酶水平方面，双因素ANOVA分析显示，基因型和酒精处理对AST和ALT均无显著主效应，但两者存在显著的交互作用。事后检验表明，酒精暴露显著升高了WT小鼠的AST水平，但在KO小鼠中未观察到这种升高。有趣的是，在基线状态下，KO小鼠的ALT水平显著高于WT小鼠，而酒精暴露仅使WT小鼠的ALT升高，对KO小鼠的ALT则无影响。
在组织学评分方面，酒精处理对门脉炎性浸润、界面炎性浸润和脂肪变性评分均有显著的主效应。门脉炎性浸润评分在酒精处理的WT和KO小鼠中均显著增加。界面炎性浸润评分仅在WT酒精组中显著增加。脂肪变性评分在WT和KO酒精组中均显著增加。关键的是，在所有组织学损伤评分上，酒精处理的WT与KO小鼠之间均未发现显著差异。相关分析显示，所有组织学参数（脂肪变性、门脉及界面炎性浸润）之间均存在显著正相关，AST与ALT之间也存在显著正相关，但组织学参数与肝酶水平之间无显著相关性。
讨论
本研究首次通过RNAscope ISH技术，在形态学背景下明确了Trpa1mRNA在小鼠肝细胞和肝脏巨噬细胞中的表达，弥补了传统PCR和可疑的免疫组化抗体在定位方面的不足。考虑到肝细胞和库普弗细胞在肝脏炎症和应激反应中的不同功能，TRPA1在这两类细胞中的激活可能产生细胞特异性的效应。
体外钙成像实验证明，酒精的主要毒性代谢物乙醛在较高浓度下能够激活人源TRPA1，这与先前的计算机模拟研究结果一致。然而，在体研究中，尽管慢性酒精摄入成功诱导了WT和KO小鼠肝脏的脂肪变性和炎性浸润，但两者损伤程度并无显著差异。这一结果与最初的假设相悖，表明TRPA1并非酒精诱导的早期肝脏炎症和脂肪变性的核心介质，这些过程可能主要由TRPA1非依赖的机制介导。
值得注意的是，Trpa1KO小鼠在基线状态下即表现出更高的ALT水平，这提示TRPA1可能作为一种应激传感器，在维持基础肝脏代谢稳态中发挥作用，其缺失可能损害了细胞的应激适应保护通路。此外，肝酶水平与组织学损伤评分之间缺乏显著相关性，这突显了生化指标（反映细胞膜通透性改变和亚致死性损伤）与组织形态学改变（反映结构性病变）是评估肝损伤的两个不同但互补的维度。
尽管TRPA1在早期酒精性肝损伤中作用有限，但大量文献表明TRPA1信号通路在心脏、肾脏、皮肤等多个器官的纤维化进程中扮演重要角色。因此，研究者推测TRPA1可能在ALD晚期纤维化阶段发挥作用。本研究使用的3个月酒精模型主要模拟了疾病的早中期阶段，并未诱导出明显的纤维化，因此TRPA1在肝脏纤维化中的作用有待未来通过延长酒精暴露时间或采用“暴饮+慢性”模型等实验进一步验证。
本研究存在一定局限性。首先，使用的是发育性Trpa1KO小鼠，不能排除因基因缺失导致的代偿机制（如其他TRP通道的上调）。其次，实验仅使用了雄性小鼠，这限制了研究结论在性别上的普适性，因为酒精相关行为、代谢调节及疾病机制可能存在性别差异。
结论
本研究成功证实了Trpa1mRNA在肝细胞和肝脏巨噬细胞中的表达，并证明乙醛能够激活人源TRPA1。然而，研究结果表明，慢性酒精暴露诱导的脂肪变性和炎性浸润主要通过不依赖于TRPA1的机制发生。TRPA1离子通道是否在ALD相关的晚期肝纤维化中起作用，仍需未来实验探索。确认TPRA1在晚期毒性肝损伤背景下的介导机制，可能将其定义为一个缓解ALD有害效应的潜在新药靶点。
未来方向
未来的研究方向将直接评估TRPA1在肝纤维发生中的作用，包括采用延长酒精暴露的模型、进行纤维化特异性染色（如天狼星红）、定量分析胶原沉积、评估肝星状细胞活化标志物（如α-平滑肌肌动蛋白）、分析促纤维化信号通路（如转化生长因子-β），以及使用TRPA1信号药理抑制剂。此外，纳入雌性小鼠的研究对于明确酒精性肝损伤及其进展中是否存在性别特异性差异也至关重要。
