《International Journal of Molecular Sciences》：ROS-Fueled Allies: STAT3, PKM2, and HIF-1α Influencing Energy Metabolism in Hormone-Independent Cancers
Sara Fiorini,
Bruno Maras,
Giuseppina Mignogna,
Monia Perugini,
Fabrizio Retali,
Giorgia Meschiari,
Alberto Macone,
Sofia Botta,
Fabio Altieri and
Marco Minacori
+ 1 author
编辑推荐：
本综述系统阐述了STAT3-PKM2-HIF-1α信号轴及其与活性氧（ROS）的协同作用，是驱动激素非依赖性乳腺癌和前列腺癌发生Warburg效应、代谢重塑及治疗抵抗的核心机制。研究发现靶向此轴可逆转癌细胞代谢表型，抑制增殖，为开发新型治疗策略提供了重要分子基础。
激素非依赖性乳腺癌和前列腺癌是高度恶性的肿瘤类型，其特点包括深刻的代谢重编程、升高的氧化应激以及对内分泌治疗的敏感性丧失。越来越多的证据表明，肿瘤进展和代谢可塑性由连接转录调控与能量代谢的相互关联的信号网络所支持。其中，由活性氧（ROS）在功能上强化的STAT3–PKM2–HIF-1α信号轴，被认为是瓦博格（Warburg）表型和细胞应对不利微环境条件适应性的核心调节因子。在这项研究中，我们利用雄激素非依赖性前列腺癌细胞（DU145）和三阴性乳腺癌细胞（KPL-4）进行研究，证实了STAT3、PKM2和HIF-1α存在组成性激活和相互调控。
1. 简介
癌症是全球主要的健康挑战。世界卫生组织等机构的估计表明，到2040年，全球将有约2990万新发癌症病例和1530万癌症相关死亡。在常见癌症中，激素依赖性癌变，特别是乳腺癌和前列腺癌，占美国发病率的很大一部分，并且是主要的死亡原因。内分泌疗法是这两种恶性肿瘤的主要治疗方法，可延长生存期并提高生活质量。肿瘤学研究的一个主要挑战是，乳腺癌和前列腺癌经常进展到激素抵抗状态，导致更具侵袭性的疾病。多种分子机制驱动这种抵抗，主要涉及激素特异性通路（乳腺癌中的雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）轴，前列腺癌和乳腺癌中的雄激素受体（AR）轴）的改变，以及允许肿瘤不依赖于雌激素或雄激素生长的旁路通路的激活。乳腺癌也可能失去ER表达，使ER靶向治疗无效，而前列腺癌通常表现出AR扩增，使细胞对低雄激素水平过敏，并且即使在标准激素治疗大幅抑制雄激素水平的情况下也能增殖。
为了阐明内分泌抵抗发展的机制，研究集中在激素受体与其他信号级联之间的串扰上。然而，由激素、生长因子、细胞因子、ROS和各种代谢物组成的肿瘤微环境也会影响肿瘤的发展和大小。激素、生长因子和细胞因子介导与ER-AR通路的信号串扰。作为氧化应激指标的ROS，通过促进DNA损伤、抑制免疫、刺激血管生成和模拟有利于耐药性的缺氧条件，有助于肿瘤发生的所有阶段。肿瘤微环境中的代谢物反映了癌细胞根据组织背景和疾病阶段重编程的代谢通路的相对活性。这种代谢灵活性使细胞能够适应治疗诱导的环境变化，促进药物抵抗和降低治疗效果。
乳酸是在肿瘤组织中积累的关键代谢物，其浓度超过40 mM，远高于生理水平。这反映了瓦博格效应，由c-Myc和STAT3等致癌基因驱动，这些致癌基因上调包括HK2和PKM2在内的糖酵解酶。在激素非依赖性肿瘤中，这一过程可能涉及被称为“Warburg恶性循环”的STAT3–PKM2–HIF-1α蛋白回路。STAT3、PKM2和HIF-1α在癌变中扮演着相互关联的角色。STAT3在大多数癌症中组成性激活，并通过经典和非经典途径驱动肿瘤发展。PKM2在肿瘤中经常过度表达，并通过其二聚体（核）形式和四聚体（胞质）形式之间的功能转换促进增殖和转移，二聚体形式促进肿瘤生长，四聚体形式在缺氧或过度增殖条件下维持糖酵解。在缺氧条件下稳定的HIF-1α，调节参与糖酵解、生存、血管生成和治疗抵抗的基因，从而支持肿瘤进展。
这个恶性循环可以由PKM2的负变构调节启动，从而促进其从胞质四聚体向核二聚体形式的转变。在细胞核中，PKM2作为蛋白激酶使STAT3在Tyr705位点磷酸化，激活其经典通路。然后STAT3上调HIF-1α的表达，而HIF-1α反过来诱导PKM2的转录，从而维持一个自我扩增的循环。这个回路与ROS密切相关，ROS调节所有三种蛋白的活性，并且可能是该循环的组成部分。鉴于代谢重编程在维持恶性表型中的核心作用，通过选择性代谢物、特异性抑制剂或调节ROS来靶向该轴，可能代表激素非依赖性肿瘤中一种有前景的治疗策略。此类干预措施可以部分恢复生理性代谢程序，并可能使肿瘤对常规疗法重新敏感。
2. 结果
2.1. 丝氨酸、N-乙酰半胱氨酸和S3I-201作为蛋白循环的调节剂
为了研究STAT3–PKM2–HIF-1α环路，我们采用了针对其单个组分和作为其驱动力的ROS的调节策略。L-丝氨酸作为PKM2的正变构调节剂，稳定了该酶的四聚体形式，这种形式催化效率高，更倾向于导向氧化代谢的糖酵解通量。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是一种抗氧化剂，用于降低作为氧化应激主要介质的ROS水平。此外，鉴于STAT3作为环路核心节点和触发器的关键作用，使用了STAT3抑制剂S3I-201来直接阻断其磷酸化、二聚化和核转位。基于这些前提，用浓度为1 mM的NAC、1 mM的丝氨酸和100 μM的S3I-201处理两种细胞系。处理持续时间为48小时。
2.2. 免疫荧光和蛋白质印迹分析用于评估环路调节
用丝氨酸、NAC和S3I-201分别处理DU-145和KPL-4细胞系，并与未处理的对照样品进行比较。处理后，通过免疫荧光和蛋白质印迹分析评估了所分析蛋白的激活状态和细胞定位。在所有检查的蛋白质中，免疫荧光和蛋白质印迹分析结果一致。705STAT3的细胞分布。">显示，在两种细胞系中，STAT3的磷酸化及其核定位在处理后均降低，在NAC和S3I-201暴露下观察到更显著的效果。结果表明，丝氨酸727位点的磷酸化和线粒体定位在处理后降低。
2.3. STAT3抑制对环路的影响
在用STAT3抑制剂处理的样品中，STAT3被有效抑制，表现为Y705和S727两个残基上均无磷酸化。相应地，STAT3在核和线粒体组分中的水平显著降低，几乎检测不到。关于PKM2，结果与STAT3抑制一致，证实了其在环路中的核心作用。观察到总PKM2表达水平降低，核组分中降低更明显。这一发现支持了以下假设：抑制作为HIF-1α转录因子的STAT3，而HIF-1α反过来调节PKM2表达，导致PKM2下调。此外，由于S3I-201也抑制STAT3的线粒体活性，从而降低其对Warburg效应的贡献，可以预期细胞条件将更有利于PKM2的胞质四聚体形式，而不是核二聚体形式。最后，HIF-1α的表达也显著降低。
2.4. 丝氨酸对环路的影响
丝氨酸作为PKM2的正变构调节剂，稳定了该酶的胞质四聚体形式，从而防止其核转位，在核内PKM2作为STAT3的激酶使其在Y705位点磷酸化，并作为HIF-1α的转录辅助因子。因此，预计用丝氨酸处理会导致STAT3在Y705位点的磷酸化及其核转位减少。此外，由于PKM2四聚体形式促进氧化代谢的重新激活，预计STAT3在S727位点的磷酸化也会随之降低。用丝氨酸处理的两种细胞系均显示出两个残基（Y705和S727）上STAT3磷酸化的显著降低，同时核和线粒体组分中STAT3表达水平也较低。正如假设的那样，PKM2没有转位到细胞核，在总蛋白组分中清晰可检测，而其水平在核提取物中显著降低。与对照组相比，丝氨酸处理样品中HIF-1α的表达在总蛋白和核蛋白组分中也降低了，这与PKM2作为其转录调节因子之一的作用一致。丝氨酸对HIF-1α表达的抑制作用不如STAT3抑制后观察到的明显，这可能是因为STAT3本身通过多种机制参与HIF-1α的表达和稳定，从而产生更显著的抑制效果。
2.5. NAC对环路的影响
ROS是氧化应激的标志物，被认为是与所分析环路共同作用的成分，因为正如前面所描述的，它们代表了更具侵袭性的肿瘤表型或癌症晚期阶段的特征。此外，ROS有助于环路内所有三种蛋白的激活，从而充当其“燃料”。因此，用抗氧化剂NAC处理以降低细胞内ROS水平，恢复更平衡的氧化还原状态。获得的结果表明，在两种细胞系中，与对照相比，STAT3在Y705和S727位点的磷酸化均降低，并且在核和线粒体区室中的定位也减少。PKM2主要在总蛋白组分中被检测到，细胞核中极少。HIF-1α也观察到类似的趋势，尽管降低更显著，这与其受STAT3和PKM2的转录调节以及受ROS稳定的特性一致。因此，清除ROS不仅限制了STAT3和PKM2的激活，还促进了HIF-1α的降解，共同导致其整体表达的显著降低。
2.6. 检测ROS
ROS被定义为信号环路的驱动力；因此，确定选择用于抑制环路的处理是否也影响ROS的产生具有特别的意义。两种细胞系接受相同的处理，48小时后，使用CellROX? Green Reagent Kit揭示细胞内ROS水平。正如预期的那样，NAC处理后观察到最显著的荧光降低。然而，在用丝氨酸或S3I-201处理的细胞中也明显观察到荧光降低。这一发现尤为重要，因为它突出了氧化应激与STAT3/PKM2/HIF-1α环路之间的相互作用。的确，抑制ROS对环路有明显的抑制作用，而反过来，抑制环路组分会导致ROS产生减少。这些观察结果支持氧化应激和环路激活之间存在积极的协同关系，这可能是维持发酵代谢表型和癌症发生后期（即肿瘤促进、进展、转移和化疗抵抗）细胞条件的基础。
2.7. Ki67的检测
在之前的实验中，我们证明了可以通过使用针对其单个组分和作为其驱动力的ROS的特定抑制剂来负向调节环路，形成功能性的串联伙伴关系。获得的结果表明了分子水平上的效应，显示了激活机制（如蛋白磷酸化）和所涉及分子的亚细胞转位的抑制。然而，确定这些分子事件是否影响肿瘤表型至关重要。作为第一步，我们研究了应用的处理是否可以降低通常在三阴性乳腺癌和雄激素非依赖性前列腺癌细胞中观察到的高侵袭性和高增殖能力。如前所述，这些特征的标志物是Ki67蛋白，这是一个公认的肿瘤细胞增殖指标。在处理过的样品中，遵循相同的实验方案（唯一的变量是处理72小时），制备总蛋白提取物并通过免疫荧光进行分析。定性显示，所有处理过的样品中Ki67荧光均降低，在NAC和S3I-201处理的样品中降低更明显。这些发现提供了初步证据，表明环路及其ROS相关相互作用的负向调节可以重塑肿瘤表型特征，使其向侵袭性更低的特征转变。
2.8. DU145和KPL-4细胞中丙酮酸与乳酸比率的调节
三阴性乳腺癌和雄激素非依赖性前列腺癌的特征是主要的发酵代谢表型，通常称为瓦博格效应。先前的研究已经确立了STAT3–PKM2–HIF-1α环路及其功能伙伴ROS水平与这种代谢重编程之间的强关联。因此，基于我们的分子数据，抑制环路和ROS水平有望以发酵代谢为代价恢复氧化代谢。为了验证这一假设，对在相同实验条件下处理48小时的DU145和KPL-4细胞系的培养基进行了气相色谱-质谱（GC–MS）分析，以定量丙酮酸和乳酸水平。直方图显示，在所有三种处理条件下，丙酮酸与乳酸的比率均高于对照组，其中NAC处理样品中观察到显著增加。这一发现可以解释为ROS激活了环路中的所有三种蛋白，并对细胞能量代谢产生直接影响。因此，减少ROS会产生比其他处理更显著的代谢转变。在S3I-201和丝氨酸处理之间也观察到了差异，S3I-201产生更强的效果。这一结果与S3I-201的作用机制一致，它抑制STAT3，从而影响环路和能量代谢的多个组分，而丝氨酸主要靶向PKM2，导致相对较弱的效果。
2.9. 克隆形成试验
进行了克隆形成试验，这是一种体外评估单个细胞形成集落的繁殖能力的方法。该试验代表了评估天然或合成化合物对细胞存活和增殖影响的标准方法，并允许评估处理如何影响细胞生长和分裂。在两种细胞系中，使用与之前实验相同的实验条件进行处理两个月。集落的图像和定量分析计数表明，所有三种化合物都降低了两种细胞系的克隆形成能力。与丙酮酸/乳酸测定结果一致，最显著的效果出现在NAC处理之后，其次是STAT3抑制剂，最后是丝氨酸。这种对三种化合物的差异反应可归因于，如前所述，它们各自的靶点在环路中的不同作用。
3. 讨论
乳腺癌和前列腺癌分别代表了女性和男性中最普遍的激素依赖性恶性肿瘤，因此构成了全球主要的公共卫生问题。激素依赖性肿瘤的一个标志是它们能够激活替代性或补偿性的生长和存活途径，导致激素抵抗的出现。这种情况反映了向更具侵袭性的肿瘤表型的转变，并且通常与治疗抵抗相关。激素抵抗背后的分子机制——例如类固醇激素受体的突变或下调以及前列腺癌和乳腺癌中非激素信号通路的激活——已有充分记载。然而，越来越多的实验证据表明，激素抵抗也由氧化还原信号和细胞能量代谢的失调驱动。这些改变促进了全局转录重编程、短暂的细胞周期停滞和肿瘤干性的维持。事实上，激素抵抗的癌细胞依赖于几种适应性策略——单独或同时激活——包括代谢重编程、表型可塑性、肿瘤微环境重塑和不受控制的增殖。
考虑到氧化还原稳态和能量代谢在癌变中的核心作用，特别是在支持肿瘤细胞在不利条件（如营养缺乏、缺氧、ROS积累或治疗诱导的细胞应激）下的生存，我们假设前列腺癌和乳腺癌尽管存在生物学异质性，但可能共享共同的细胞机制。这一假设得到了以下事实的支持：两种恶性肿瘤都表现出对性激素的早期依赖性、赋予治疗抵抗的类固醇受体分子改变以及趋同的信号通路，特别是那些参与类固醇激素代谢和IGF-1信号的通路。代谢研究表明，在激素抵抗的背景下，两种肿瘤类型都表现出代谢途径的主要改变，包括糖酵解、谷氨酰胺、甘氨酸和脂质代谢，并且以深刻的氧化应激为特征。因此，我们假设激素抵抗的前列腺癌和乳腺癌可能共享以下特征：STAT3经典和非经典通路的组成性激活；糖酵解代谢表型；以及富含ROS的微环境。这促使我们研究这两种肿瘤类型是否也表现出STAT3–PKM2–HIF-1致癌环路的激活，并得到ROS的支持。这个回路控制着内分泌抵抗发生和进展的关键过程，当被ROS强化时，促进从氧化磷酸化到有氧糖酵解（瓦博格效应）的代谢转变。
我们的研究结果证实，这个环路在激素抵抗的前列腺癌和乳腺癌细胞系中都是活跃的。我们假设，抑制或负向调节环路及其ROS伙伴关系将使细胞代谢重新转向OxPhos，并恢复氧化程度更低的氧化还原状态，从而重建更接近生理稳态的微环境和细胞内条件。用S3I-201处理有效抑制了STAT3的经典和非经典通路，导致HIF-1表达减少、ROS产生降低以及PKM2的胞质定位增加。用丝氨酸（一种增殖细胞的典型代谢物）调节PKM2也减少了STAT3通路的激活，并导致HIF-1表达降低和Warburg表型的减弱。最后，用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理，可缓冲ROS，对环路的所有三种蛋白产生联合作用，导致环路完全抑制，并恢复了以下特征的分子谱：胞质、非活性的STAT3和PKM2；HIF-1表达减少（通过转录抑制和蛋白酶体降解）；以及ROS水平的显著降低。
在功能上，环路抑制恢复了非转化细胞的典型特征，包括乳酸产生减少并伴随丙酮酸水平恢复；Ki-67表达显著减少，表明增殖和肿瘤侵袭性降低；以及处理细胞与未处理细胞相比克隆形成能力急剧下降。此外，STAT3–PKM2–HIF-1/ROS环路的负向调节增强了DU-145和KPL4细胞的化学敏感性。在分子和功能水平上，最显著的反应出现在NAC处理和STAT3抑制之后，突出了STAT3作为与ROS伙伴关系中的HIF-1α–PKM2–STAT3致癌环路核心节点的核心作用。通过其经典通路，STAT3增强HIF-1转录并间接调节PKM2表达，而通过其非经典通路，它通过增加ROS水平促进慢性氧化应激，而ROS反过来又加强了环路的激活。因此，像NAC这样的抗氧化剂会产生特别强大的细胞反应，因为它同时靶向环路的所有组分和ROS伙伴关系，而直接的STAT3抑制则特异性抑制环路活性，并次要地减少ROS。
总的来说，我们的研究结果是有前景的，并为与肿瘤进展至更具侵袭性的激素抵抗表型相关的代谢改变和氧化应激条件，以及抗癌治疗诱导的变化提供了新的见解。此外，它们表明，对代谢酶、氧化还原状态以及调节这些过程的蛋白通路的综合研究，可能有助于识别新的分子靶点或生物标志物，最终为具有相似临床和分子特征的患者亚群开发个性化的治疗策略。
4. 材料与方法
4.1. 细胞培养
人前列腺癌细胞系DU-145和人乳腺癌细胞系KPL-4购自美国典型培养物保藏中心。细胞在37°C、5% CO2条件下生长至80%汇合度，使用适当的培养基（RPMI 1640或DMEM-LG，根据细胞系而定），并补充1%丙酮酸钠、10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素。L-丝氨酸在DU-145和KPL-4上以1 mM的最终浓度进行测试。N-乙酰-L-半胱氨酸在DU-145和KPL-4上以1 mM的最终浓度进行测试。使用的STAT3抑制剂是100 μM S3I-201。
4.2. 蛋白质提取和免疫印迹
蛋白质提取和免疫印迹分析基本按照Rubini等人的方法进行。在6孔板中培养细胞，密度为每孔300,000个细胞，通过离心收集，并用PBS洗涤。总蛋白提取物使用裂解缓冲液获得。使用低渗缓冲液从细胞沉淀中获得细胞核。蛋白质通过SDS-PAGE 10% TGX FastCastTM丙烯酰胺凝胶分离，并使用Trans-Blot?TurboTM转移系统转移到PVDF膜上。膜用3% BSA或0.2% w/v I-block在含有0.05% Tween-20的Tris缓冲盐水（TBS-T）中封闭，并用特异性一抗孵育1小时。随后，膜在TBS-T中洗涤三次，然后用磷酸酶偶联的二抗或StarBright Blue 520或700荧光二抗孵育一小时。碱性磷酸酶信号用BCIP/NBT试剂检测。蛋白质条带强度使用ImageLab Software量化。膜图像由Molecular Imager?ChemiDoc? MP System采集。使用特异性一抗进行检测。
4.3. 免疫荧光
免疫荧光分析基本按照Cocchiola等人的方法进行。DU-145、KPL-4细胞在盖玻片上生长。细胞用1 mM丝氨酸和1 mM NAC处理48小时，并用100 μM S3I-201处理24小时。生长在盖玻片上的细胞用PBS洗涤，用4%甲醛固定15分钟，然后用PBS冲洗。细胞用冷甲醇（-20°C）透化5分钟。用PBS洗涤三次后，细胞用3% w/v BSA在PBS中封闭过夜。固定细胞用特异性一抗进行免疫荧光染色处理1小时。随后，在黑暗中用FITC偶联的二抗孵育1小时。细胞核用Hoechst复染15分钟。用PBS-T洗涤后，盖玻片用DuolinkTM封片介质封固在载玻片上，并使用荧光显微镜检查。
4.4. 线粒体染色
在固定前，用MitoTracker Orange CMT
