全反射X射线荧光光谱法揭秘掺杂纳米颗粒在肿瘤3D球体中的扩散动力学

《International Journal of Molecular Sciences》：TXRF Spectrometry for Investigating CaF2:Nd3+,Y3+ Nanoparticle Diffusion in Tumoral Cancer 3D Spheroids Ramón Fernández-Ruiz, Pablo Camarero, Patricia Haro-González and Marta Quintanilla

本研究首次应用高灵敏度的全反射X射线荧光（TXRF）技术，建立了一种可精确量化稀土掺杂纳米颗粒在三维肿瘤球体内累积与扩散的微分析方法。通过对胶质母细胞瘤（U-87 MG）和乳腺癌（MCF-7）3D球体模型的研究，揭示了纳米颗粒摄取存在显著的细胞系依赖性差异，为基于纳米颗粒的肿瘤靶向诊疗（纳米诊疗学）提供了关键的定量评估新策略。

　　

本研究旨在深入理解掺杂钕（Nd³⁺）和钇（Y³⁺）的氟化钙（CaF₂:Nd³⁺,Y³⁺）纳米颗粒与复杂肿瘤模型的相互作用，以推进其在纳米医学领域的应用。该纳米颗粒因其独特的光学性质（如用于光学传感和温度测量）而展现出潜力。研究选用源自人胶质母细胞瘤细胞系（U-87 MG）和人乳腺癌细胞系（MCF-7）的三维（3D）细胞球体作为肿瘤模型，相较于传统二维（2D）培养，能更好地模拟实体瘤的微环境。

2. 结果与讨论

2.1. 定性评估

研究首先对处理后的球体样品进行了定性评估。TXRF光谱显示，在暴露于纳米颗粒的U-87 MG和MCF-7球体中，均能清晰检测到来自纳米颗粒组分的钙（Ca）、钕（Nd）和钇（Y）的特征信号。通过对比光谱，发现纳米颗粒相关的信号强度在U-87 MG球体中明显高于MCF-7球体，初步定性地表明纳米颗粒在胶质母细胞瘤球体中的积累量更高。

2.2. 对照球体的基线元素谱

对未经纳米颗粒处理的U-87 MG对照球体的分析表明，磷（P）、硫（S）、氯（Cl）、钾（K）等元素的浓度与球体数量呈线性正相关，证实了TXRF能够灵敏地定量细胞内源元素。值得注意的是，在对照样本中未检测到Nd和Y，而背景中的钙信号极低，确保了后续纳米颗粒量化分析的准确性。

2.3. 分析参数

2.3.1. 平均浓度与检出限

对暴露于750 ppm纳米颗粒的U-87 MG球体进行定量分析，获得了各元素的平均浓度、变异系数和检出限。结果显示，该方法对Ca、Nd、Y等纳米颗粒组分以及P、K、Cu、Zn等细胞元素均具有高灵敏度，所有测量值均高于其对应的检出限。

2.3.2. CaF₂:Nd³⁺,Y³⁺纳米颗粒的化学计量回收

通过TXRF测定了纳米颗粒在球体内及在胶体悬浮液中的化学计量组成。结果表明，测量得到的CaF₂、Y、Nd的质量百分比与理论合成比例（88.3:10.05:1.6 wt%）高度吻合，回收率在96%至109%之间，证明了TXRF测量的可靠性，且纳米颗粒的生物累积和消化过程未改变其化学计量。

2.3.3. 加标回收评估

通过在已处理的样品中添加已知量的Ca和Y标准品进行加标回收实验，Ca和Y的平均回收率分别为109%和102%，接近100%，表明基质干扰可忽略不计，TXRF分析准确性高。

2.3.4. 不确定度评估

研究评估了TXRF测量中的三种主要不确定度来源：方法学不确定度、样品沉积粗糙度不确定度和仪器不确定度。结果显示，平均不确定度趋势为：方法学不确定度（约10.2%）> 粗糙度不确定度（约4.3%）> 仪器不确定度（约3.5%），这与预期一致。对于Fe、Cu、Zn等痕量元素，由于浓度极低和沉积物复杂的3D形貌，其不确定度行为略有异常。

光学显微镜和3D投影图像揭示了样品沉积在TXRF反射体上形成的复杂、粗糙的“火山”形态，这解释了部分痕量元素测量变异性较高的原因。

2.3.5. 沉积物化学均匀性验证

通过微区X射线荧光（μ-XRF）对同一沉积物进行元素面扫描分析。结果显示，代表细胞组成的元素（P, S, K, Ca）与作为内标（IS）的镓（Ga）在空间上呈相似的环状分布，表明分析物与内标分布一致，避免了因空间异质性导致的TXRF定量失真。

2.4. CaF₂:Nd³⁺,Y³⁺纳米颗粒的摄取

2.4.1. 浓度依赖性纳米颗粒摄取

在固定孵育时间下，研究了不同纳米颗粒浓度对两种细胞球体摄取的影响。结果显示，U-87 MG球体在所有测试浓度下摄取的纳米颗粒绝对量均显著高于MCF-7球体，在750 ppm浓度时高出约四倍。两种球体的摄取均表现出饱和趋势，但单位浓度的细胞摄取百分比随孵育浓度增加而线性下降。

差异可能源于两种球体截然不同的三维形态。光学显微镜图像显示，U-87 MG形成的球体更粗糙、多孔且体积更大，而MCF-7球体则更致密光滑。U-87 MG球体更大的表面积、孔隙率和细胞间隙可能为纳米颗粒-细胞相互作用提供了更多位点，从而促进了细胞内化。

2.4.2. 时间依赖性纳米颗粒摄取

在固定纳米颗粒浓度下，研究不同孵育时间对摄取的影响。同样，U-87 MG球体的摄取量始终高于MCF-7。随时间推移，纳米颗粒进入球体的速率逐渐降低，MCF-7球体较早达到摄取饱和平台，而U-87 MG球体在实验时间窗内未观察到明显饱和。

2.4.3. 纳米颗粒扩散动力学分析

为深入表征摄取过程，研究采用基于威布尔（Weibull）扩散模型对时间依赖性的摄取数据进行了拟合。该模型常用于描述复杂药物释放动力学，尤其适用于具有径向几何结构的体系（如球体）。对于MCF-7球体，拟合参数表明其摄取遵循亚指数（扩散主导）动力学，最终纳米颗粒负载量较低。而对于U-87 MG球体，拟合参数则提示其为加速动力学模式，具有更高的最大负载潜力和更长的特征时间常数，表明其在实验时间内具有持续、显著的纳米颗粒积累能力。这些差异进一步证实了纳米颗粒在两种肿瘤球体中的扩散行为存在本质不同。

3. 材料与方法

研究使用布鲁克S2 PicoFox TXRF光谱仪进行分析。CaF₂:Nd³⁺,Y³⁺纳米颗粒通过水热法合成，尺寸约为14 ± 3 nm，形貌均一。

U-87 MG和MCF-7细胞在超低吸附U型底96孔板中培养形成3D球体。通过更换含有不同浓度纳米颗粒的培养基对球体进行处理，并系统研究了浓度和时间效应。

处理后的球体经过定制设计的微消化系统，使用超纯硝酸进行消化，以完全分解球体和纳米颗粒。

消化后，样品通过添加镓（Ga）作为内标进行标准化，最终制备成用于TXRF分析的液滴。

4. 结论

本工作成功证明，TXRF光谱法是一种强大、快速、准确的分析技术，可用于定量研究稀土掺杂纳米颗粒在3D肿瘤球体模型中的内化和扩散。研究开发并验证了一套完整的微消化与标准化TXRF分析流程，具有高灵敏度、低检测限和高准确性。应用该方法揭示了CaF₂:Nd³⁺,Y³⁺纳米颗粒在胶质母细胞瘤（U-87 MG）和乳腺癌（MCF-7）3D球体中的摄取存在显著的细胞系依赖性差异，U-87 MG球体的摄取量远高于MCF-7球体。这种差异很可能归因于两种球体在三维结构、孔隙率、表面积和细胞间微观结构方面的不同。对摄取动力学的威布尔模型分析进一步量化了这种差异，表明二者遵循不同的扩散机制。这些发现强调了在评估用于靶向癌症诊疗的纳米颗粒系统时，考虑肿瘤特异性相互作用的重要性。该研究建立的方法和获得的见解，为基于纳米颗粒的纳米诊疗学在迈向体内实验前，提供了一个更接近真实肿瘤微环境的体外评估平台。