白头翁皂苷B4通过AMPK/Nrf2通路缓解奶牛乳腺上皮细胞的氧化损伤与凋亡

《Antioxidants》：Pulsatilla Saponin B4 Alleviates H2O2-Induced Oxidative Stress and Apoptosis via the AMPK/Nrf2 Pathway in Bovine Mammary Epithelial Cell Models Hao Zhang, Shouli Yi, Panpan Ding, Baocheng Hao, Dan Shao and Shengyi Wang

本研究首次阐明白头翁皂苷B4（PSB4）通过激活AMPK/Nrf2信号轴，有效缓解H2O2诱导的奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）氧化应激和细胞凋亡，为开发天然产物来源的抗氧化剂以保护奶牛乳腺健康和提升乳品质提供了新机制和潜在应用价值。

　　

奶牛是重要的产乳动物，在泌乳期，乳腺组织极高的代谢需求导致活性氧（ROS）大量积累，从而打破氧化还原平衡，诱发氧化应激。这直接损伤乳腺上皮细胞，降低产奶量和乳品质，最终带来巨大的经济损失。因此，缓解氧化应激对于保障奶牛乳腺健康至关重要。天然产物单体白头翁皂苷B4（PSB4）被证实具有抗氧化活性，但其对奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）氧化损伤的具体保护作用与机制尚不完全清楚。本研究旨在阐明PSB4对H₂O₂诱导的BMECs氧化损伤的保护作用及其分子机制。

PSB4改善H₂O₂诱导的BMECs细胞活力下降

细胞毒性实验确定了PSB4的非毒性浓度范围，并优化了H₂O₂处理浓度和时间以建立氧化应激模型。研究发现，与未处理对照组相比，用100-800 μg/mL PSB4处理BMECs 12或24小时，细胞活力无显著变化，而900 μg/mL PSB4在两次检测时均显著损伤了细胞活力。因此，低于900 μg/mL的浓度被定义为无细胞毒性。H₂O₂处理结果显示，用500 μM H₂O₂处理12小时可显著降低细胞活力，因此被选为后续研究的氧化应激条件。保护实验表明，与H₂O₂处理组相比，不同浓度的PSB4（25, 50和100 μg/mL）能够显著恢复细胞存活率，证实PSB4可有效减轻H₂O₂对BMECs活力的损害。

PSB4缓解H₂O₂诱导的BMECs氧化应激

为阐明PSB4对氧化应激的作用，研究检测了关键抗氧化指标和ROS水平。结果显示，H₂O₂刺激导致总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性或含量显著降低，同时显著增加了丙二醛（MDA）和ROS的水平。相比之下，PSB4处理能够剂量依赖性地逆转H₂O₂诱导的T-AOC、SOD和GSH-Px活性下降，并显著抑制MDA水平和ROS的过度积累。这共同表明，PSB4通过恢复抗氧化酶活性和减轻MDA与ROS水平的升高，减轻了H₂O₂对BMECs的氧化损伤。

PSB4在H₂O₂诱导的BMECs中发挥抗凋亡作用

进一步研究表明，H₂O₂处理显著降低了JC-1聚集体/单体的荧光比率，而PSB4干预以剂量依赖性方式逆转了这一下降。流式细胞术分析也显示，H₂O₂处理显著增加了BMECs的凋亡率，而PSB4则以浓度依赖的方式降低了凋亡率。在蛋白水平上，H₂O₂显著抑制了抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2（BCL2）的表达，并降低了BCL2/BCL2相关X蛋白（Bax）的比率，同时显著升高了裂解的胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）水平。高剂量的PSB4处理可显著恢复BCL2表达，提高BCL2/Bax比率，并以剂量依赖的方式抑制Cleaved Caspase-3的上调。这些结果表明，PSB4可有效减轻H₂O₂诱导的BMECs损伤。

PSB4在H₂O₂刺激的BMECs中调节AMPK/Nrf2信号通路

为探究PSB4缓解氧化应激的机制，研究分析了AMPK/Nrf2通路关键蛋白及其下游靶基因的表达。研究发现，H₂O₂刺激显著抑制了核因子E2相关因子2（Nrf2）的蛋白表达，并降低了AMP活化蛋白激酶（AMPK）的磷酸化水平。PSB4处理可剂量依赖性地恢复H₂O₂对p-AMPK和Nrf2表达的抑制作用，并促进Nrf2的核转位。同时，PSB4可剂量依赖性地逆转H₂O₂诱导的抗氧化基因（谷氨酸-半胱氨酸连接酶修饰亚基（GCLM）、血红素氧合酶-1（HO-1）、NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）和谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1））的下调。这表明PSB4可能通过激活AMPK/Nrf2通路来缓解H₂O₂诱导的BMECs氧化还原失衡。

PSB4通过AMPK信号在H₂O₂刺激的BMECs中发挥抗氧化特性

为验证PSB4是否通过AMPK信号通路发挥作用，研究引入了AMPK特异性抑制剂化合物C（CC）。结果表明，PSB4处理促进了Nrf2的核转位，而CC的加入逆转了这一效应。同时，PSB4有效减弱了H₂O₂诱导的ROS积累，但CC显著削弱了PSB4的这种保护作用。在蛋白水平上，PSB4显著抵消了H₂O₂介导的Nrf2蛋白表达抑制和AMPK磷酸化抑制，而CC则明显阻断了PSB4的作用。在转录水平上，H₂O₂显著抑制了抗氧化反应基因的表达，PSB4干预显著增加了这些基因的表达，而AMPK抑制剂CC的加入则逆转了PSB4的效应。这些结果表明，PSB4通过调节AMPK信号激活下游Nrf2通路，从而缓解H₂O₂诱导的BMECs氧化应激。

PSB4通过AMPK通路减轻H₂O₂诱导的BMECs凋亡

验证PSB4是否通过AMPK信号减轻凋亡的研究发现，H₂O₂显著降低了线粒体膜电位，而PSB4处理显著恢复了该电位，但CC的引入抵消了PSB4的保护作用。流式细胞术分析显示，H₂O₂显著增加了BMECs的凋亡率，PSB4显著减轻了H₂O₂诱导的凋亡，而这一效应被CC显著逆转。同时，H₂O₂导致抗凋亡蛋白BCL2表达显著降低，Cleaved Caspase-3水平显著升高。PSB4应用有效逆转了H₂O₂介导的BCL2抑制和Cleaved Caspase-3升高，但这些效应被AMPK抑制剂CC显著阻断。这些结果进一步表明，PSB4通过AMPK信号通路减轻H₂O₂诱导的BMECs凋亡，从而减轻氧化损伤。

结论

本研究证实，在所测试的浓度下，PSB4对H₂O₂诱导的BMECs氧化损伤具有明确的保护作用。其潜在机制是：PSB4激活AMPK信号，促进Nrf2核转位并上调抗氧化基因，从而抑制过量的ROS产生。同时，PSB4通过调节BCL2/Bax蛋白比率和抑制Caspase-3激活，有效阻断了线粒体凋亡通路。AMPK特异性抑制剂CC能够拮抗这种保护作用，表明PSB4通过调节AMPK/Nrf2/Caspase-3信号轴来缓解氧化损伤。这些发现为开发PSB4作为缓解奶牛氧化应激的营养补充剂或治疗剂提供了理论基础。