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本研究发现，在成年神经干细胞中敲除低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1），可导致海马依赖性记忆和空间记忆损伤，并引发神经元树突复杂性降低及成年海马新生神经元总数增加。该研究揭示了LRP1在神经干细胞生物学和海马神经发生中的关键作用，为理解阿尔茨海默病等记忆功能障碍疾病的病理机制提供了新视角，并强调了LRP1作为治疗靶点的潜力。
1. 引言
海马体是大脑中负责记忆形成的关键区域，它整合来自内嗅皮层、前额叶皮层、杏仁核和下丘脑等脑区的信号输入。成年大脑中，海马体是能够产生新神经元的两个确定位点之一，这种成年神经发生对海马功能至关重要。海马的神经发生微环境位于齿状回（DG）的颗粒下层（SGZ）。正常的海马功能需要新神经元产生、发育、迁移并整合到海马环路中。这一过程受到严格调控，典型表现为从基本处于静息状态的成年神经干细胞（NSC，或称Ⅰ型细胞）库，向高度增殖的前体（快速增殖）细胞（Ⅱ型）的进展。Ⅱ型细胞的后代在失去神经干细胞标志物（如GFAP和Sox2）表达，但获得神经元分化标志物（如Prox-1、双皮质素DCX和多聚唾液酸神经细胞粘附分子PSA-NCAM）表达时，发育为成神经细胞（Ⅲ型细胞）。这些成神经细胞随后迁移到颗粒细胞层（GCL），成为成熟的颗粒细胞并整合到环路中，接收内嗅皮层的输入，并将轴突作为苔藓纤维投射到海马的CA3区。在这些独特的发育阶段，发育中的神经元也可能经历自然淘汰，其自然凋亡率相对较高。
研究表明，当新生神经元的发育和整合被破坏时，海马相关的记忆会受到负面影响。反之，增强海马神经发生可以改善和保留某些形式的记忆。值得注意的是，使用局部照射来耗竭成年海马神经发生，会导致情境性恐惧条件反射和海马齿状回的长期增强作用受损。此外，杀死NSC会损害空间学习和记忆。相反，通过环境丰富化和运动可以增强神经发生。在啮齿类动物中，环境丰富化增加了齿状回的神经发生，这与莫里斯水迷宫和新型物体识别测试中更好的表现相关。此外，进行自主跑轮运动的小鼠，其成年海马神经发生和记忆（通过莫里斯水迷宫和空间模式分离测试衡量）得到改善。总之，研究有力地支持活跃的海马神经发生对认知很重要。
本研究在小鼠中发现了一种成年海马NSC的新型调节因子。我们先前在缺血损伤的背景下描述了成年NSC中低密度脂蛋白受体相关蛋白1敲除（LRP1 KO）的影响。我们特别关注LRP1，因为其与神经退行性疾病存在已知关联，并且具有改变信号调节的能力。Safina等人在体外已显示了LRP1缺失对NSC的影响，但我们是首个报告LRP1 KO如何改变体内NSC的研究。鉴于之前在脑室下区的研究发现，本研究的总体目标是调查LRP1缺失对成年海马神经发生的影响。利用利用巢蛋白驱动的可诱导Cre重组酶的转基因小鼠模型，我们在小鼠3月龄时诱导了成年NSC的LRP1 KO。我们发现，在NSC的LRP1 KO后6个月，出现了海马依赖性记忆缺陷。此外，在此时间点，我们识别到LRP1 KO细胞的神经元谱系标志物表达升高，包括表达双皮质素（DCX）和神经元核标志物（NeuN）的未成熟神经元，以及仅表达NeuN的成熟神经元。成熟神经元也显示出形态复杂性降低，这可能是观察到的海马驱动的行为改变的原因。与10月龄时成熟新生神经元数量增加相一致，我们观察到LRP1 KO诱导了海马中增殖细胞比例的增加。同样，在LRP1 KO后1个月，我们观察到成年新生细胞中程序性细胞死亡水平降低，但仅存在于暴露于行为测试的小鼠中，提示LRP1 KO可能对应激诱导的海马细胞死亡产生影响。我们的发现表明，LRP1是海马神经发生功能中一个先前未被识别但至关重要的参与者。
2. 材料与方法
2.1. 动物
所有动物程序均经UT Health机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，符合NIH指南。饲养条件为12小时光暗周期，自由取食饮水。如前所述，成年NSC特异性LRP1敲除小鼠通过杂交产生。敲除在小鼠3月龄时诱导。雄性和雌性小鼠均用于实验。在4月龄或10月龄时，小鼠被安乐死并收集脑组织。
2.2. 行为学测试
行为测试前，所有动物在其家笼中在行为测试室适应至少一小时。所有行为测试均由不知情的女性研究人员使用AnyMaze软件捕捉和分析。每个迷宫装置在小鼠之间用70%乙醇彻底清洁并晾干。测试在行为测试室内进行，使用荧光顶灯照明。
2.2.1. 高架十字迷宫
将小鼠放置在高架十字迷宫的中心，开放臂补充照明至900勒克斯以进行视频记录。允许小鼠在迷宫中不受干扰地探索5分钟。记录并分析小鼠在迷宫各臂中花费的时间、移动距离和进入次数。
2.2.2. Y迷宫
将小鼠放置在Y迷宫的中心，允许其不受干扰地探索5分钟。记录并分析移动距离、进入各臂的次数。计算自发交替百分比。
2.2.3. 巴恩斯迷宫
巴恩斯迷宫方案基于Attar等人（2013年）的研究进行了调整。为我们的实验动物，我们建立了一个包括一个“适应日”的方案，然后是连续5个“训练日”和两次“探针测试”——分别在最后一次训练后的48小时和7天。室内照明和响亮的蜂鸣器用作厌恶刺激，以鼓励小鼠进入逃生洞。一旦小鼠进入逃生洞，蜂鸣器即关闭。
2.3. 免疫组织化学
在采集日，小鼠用异氟烷/氧气麻醉，然后用PBS进行心脏灌注。提取大脑，一半快速冷冻用于未来实验，另一半置于4%多聚甲醛中过夜，进一步处理用于组织学分析。然后将大脑置于30%蔗糖/PBS中至少3天，随后浸入OCT中冷冻。将半脑冠状切片（30微米）粘附到1%明胶包被的载玻片上，干燥过夜并在-80°C冷冻储存。组织切片用PBS再水化，然后用0.2% Triton X-100/PBS透化10分钟，再用PBS洗涤。切片用苏丹黑染色10分钟，然后用PBS洗涤直至清晰。切片在5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS封闭液中孵育45分钟，然后在4°C用一抗孵育过夜。第二天，切片用PBS洗涤，在室温用二抗孵育1小时。洗涤后，切片用DAPI孵育，用去离子水洗涤，干燥过夜。载玻片用Aquapolymount封片，并在封片后数天内用共聚焦显微镜成像。
2.4. 末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）
DCX和二抗孵育后，立即用PBS洗涤切片，组织用4%多聚甲醛固定10分钟。洗涤后，对切片进行TUNEL程序。TUNEL程序完成后，切片立即用DAPI染色5分钟，用ddH2O洗涤，室温干燥过夜。用Aquapolymount封片并在数天内成像。
2.5. 形态学分析
神经元核标志物（NeuN）和双皮质素（DCX）免疫组化染色后，获取Z-stack共聚焦图像，并使用Sholl技术进行形态学分析。首先，分离出成熟神经元，然后使用tdTomato信号和SNT追踪工具生成追踪。所有追踪随后进行自动SNT Sholl分析。所有分析均在不知情的情况下进行。
2.6. 流式细胞术
小鼠在人道安乐死和解剖齿状回及脑室下区前7天，每日注射5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）。对齿状回组织进行分析，脑室下区细胞作为单通道对照用于补偿以确认正确的流式细胞术设门。流式细胞术方案进行了调整。简单来说，组织被切碎并置于消化缓冲液中，37°C消化15分钟。通过将细胞置于Percoll中，随后离心去除碎片。去除顶部碎片层，剩余的细胞悬液洗涤并通过40微米细胞滤网，重悬于PBS-葡萄糖溶液中。用小鼠CD16/CD32阻断非特异性背景。细胞用活/死细胞染色剂染色，与抗体孵育，固定，然后进行EdU点击化学反应。细胞重悬于PBS-葡萄糖溶液中并置于冰上，直到在流式细胞仪上分析。使用FlowJo软件分析数据。
2.7. 统计分析
使用GraphPad Prism进行统计评估。大多数数据通过主效应双向方差分析（ANOVA）进行分析，然后进行Sidak检验以进行个体比较。所有使用的检验以及ANOVA的统计变量均在图注中注明，而显著的比较则在图中注明并报告p值。由不知晓小鼠所属实验组的研究人员进行盲法分析。数值以平均值±标准误表示，p<0.05认为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. LRP1敲除对成年小鼠海马NSC的影响
我们之前的研究发现NSC对缺血性中风的反应发生了显著改变。鉴于海马是成年神经发生的主要部位，我们使用先前建立的小鼠模型测试了成年NSC中LRP1的缺失是否会导致任何海马表型。敲除在3月龄时诱导。在采集的组织中，没有观察到齿状回形态的明显改变，并且在每个时间点，LRP1 KO小鼠和对照组小鼠的背侧和腹侧颗粒细胞层高度相似。
3.2. 成年NSC中LRP1缺失在10月龄时诱导行为缺陷
由于我们专门研究LRP1 KO对成年海马神经发生的影响，我们采用了可能受海马功能影响的行为测试。Y迷宫用于测试工作记忆的差异。无论基因型如何，LRP1 KO小鼠和对照组小鼠在Y迷宫中探索的距离相似。通过自发交替百分比来衡量小鼠转向新迷宫臂的频率。我们发现，在10月龄时，LRP1 KO小鼠的自发交替百分比显著低于对照组小鼠，但在4月龄时没有差异。
接下来，我们使用高架十字迷宫测试小鼠是否表现出焦虑样表型。在4月龄时，LRP1 KO小鼠与对照组小鼠探索迷宫的方式相似。然而，在10月龄小鼠中，LRP1 KO小鼠的移动距离少于对照组，尽管它们表现出相似的总进入次数。10月龄的LRP1 KO小鼠倾向于在迷宫的闭合臂中花费更多时间，但在开放臂中花费的时间与对照组小鼠相似，并且开放臂进入次数与对照组小鼠的比例相似。
3.3. 成年NSC LRP1 KO导致海马依赖性记忆缺陷
为了明确测试海马驱动的行为是否受NSC中LRP1的影响，我们采用了海马功能的经典行为测量方法——巴恩斯迷宫。对于巴恩斯迷宫，我们在他莫昔芬处理后6个月，即小鼠9月龄时进行测试。我们测量了单个训练期间识别目标洞的潜伏期，发现对照组和LRP1 KO小鼠在第一次训练和最后一次训练之间识别目标的潜伏期显著下降，这表明LRP1 KO小鼠与对照组小鼠以相似的方式学习逃生洞的位置。然后，在训练后48小时和7天，探测小鼠记住逃生位置的能力。测量了小鼠在迷宫每个象限的洞上方用鼻子探查的次数，在训练后48小时和7天，LRP1 KO小鼠和对照组小鼠在目标象限内的任何洞上方的鼻子探查次数都有增加。我们还测试了单个洞上方的鼻子探查次数。在训练后48小时，LRP1 KO小鼠和对照组小鼠在目标洞上方的鼻子探查次数和花费的时间相似。然而，到训练后7天，LRP1 KO小鼠在目标洞处的鼻子探查出现缺陷，而对目标洞周围洞的探查次数增加。相比之下，对照组小鼠保留了逃生洞的位置，大多数鼻子探查集中在目标洞上方。同样，与对照组小鼠相比，LRP1 KO小鼠在目标逃生洞附近花费的时间更少。这些发现表明，KO动物保持了相似的空间学习能力，但缺乏与对照动物相同的空间记忆。
3.4. LRP1 KO不影响新生海马神经元的迁移，但诱导成年新生神经元的形态改变
我们之前表明，脑室下区的LRP1 KO诱导了NSC向缺血性病变迁移的缺陷。为了测试迁移改变是否可能是行为缺陷的基础，我们测量了tdTomato阳性细胞作为距SGZ距离函数的定位。我们发现，无论基因型如何，在4月龄时，LRP1 KO小鼠和对照组小鼠在任何给定距离处的细胞总数是相同的。到10月龄时，我们观察到LRP1 KO小鼠中位于SGZ 3-18微米处的tdTomato阳性细胞总数有上升趋势；然而，作为总细胞群的百分比，在任何给定距离处定位的细胞百分比在LRP1 KO和对照组小鼠中是相同的。
为了测试成年新生海马神经元是否具有改变的形态，我们对10月龄对照组和LRP1 KO小鼠的tdTomato阳性神经元进行了Sholl分析。在距胞体更远的距离处，LRP1 KO神经元显示出比对照组神经元更少的交叉点。Sholl衰减系数在LRP1 KO小鼠中增加，表明树突分支密度随距胞体距离的增加而更急剧地下降。总之，这些结果表明，没有LRP1，神经元无法发育或维持适当的树突结构。
3.5. 到10月龄时，LRP1 KO增加了海马中成年新生神经元的总数
为了测试成年新生神经元的分化是否受到体内海马中LRP1 KO的影响，我们测量了tdTomato阳性海马细胞共标记DCX或NeuN的数量。我们发现，到10月龄时，与对照组小鼠相比，LRP1 KO小鼠的tdTomato阳性、DCX/NeuN阴性细胞总数增加。事实上，虽然对照组小鼠中tdTomato阳性细胞的总数从4个月到10个月减少，但LRP1 KO小鼠没有显示出tdTomato阳性细胞的相同减少，表明这个细胞库得到了保留。对照组小鼠中tdTomato/DCX双阳性早期神经元的总数从4个月到10个月减少，这与在神经发生中观察到的与年龄相关的变化一致。有趣的是，在4月龄时，与对照组相比，LRP1 KO小鼠的这些tdTomato/DCX双阳性早期神经元总数减少；然而，它没有随着年龄进一步减少，到10个月时水平与对照组小鼠相似。DCX阳性细胞总数（包括tdTomato阳性和阴性）的变化是相似的，对照组小鼠的DCX阳性细胞总数随时间减少，而LRP1 KO小鼠早期与对照组相比有所减少，但随后不随年龄进一步减少。在LRP1 KO小鼠的DCX阳性细胞群中，非tdTomato表达细胞可能存在一些补偿，因为在4月龄时，与对照组小鼠相比，LRP1 KO小鼠的tdTomato阴性、DCX阳性细胞总数增加。
还统计了共表达tdTomato/DCX/NeuN的中间成熟神经元的数量，我们发现对照组小鼠在10个月时这些细胞的数量比4个月时减少，进一步提示了与年龄相关的神经发生减少。相比之下，LRP1 KO小鼠没有显示出这些共表达tdTomato/DCX/NeuN的细胞随年龄减少，因此到10月龄时，LRP1 KO小鼠比对照组小鼠拥有更多这些细胞。总的来说，DCX/NeuN阳性细胞群（无论是否表达tdTomato）受到LRP1 KO小鼠中tdTomato阳性细胞库改变的影响。虽然对照组和LRP1 KO小鼠的DCX/NeuN中间细胞的年龄相关减少，但在LRP1 KO小鼠中，减少程度较轻，因此到10个月时，LRP1 KO小鼠比对照组小鼠拥有更多这些细胞。对整个中间成熟神经元群体的这种影响可能主要归因于tdTomato阳性细胞，因为在4个月和10个月时，tdTomato阴性、DCX/NeuN阳性细胞在对照组和LRP1 KO小鼠之间是一致的。
最终，描述的成熟海马神经元库的改变导致LRP1 KO小鼠在10月龄时比对照组小鼠发育出更多成熟的tdTomato阳性、NeuN表达神经元。
3.6. 增加的神经元发育可能与增殖增加有关
增殖增加或细胞死亡减少可以解释LRP1 KO小鼠中海马神经元数量增加。为了测试改变的增殖是否可能导致分化为神经元的细胞通量增加，小鼠在采集前7天注射EdU以标记海马中的分裂细胞。使用免疫组织化学，我们发现无论基因型如何，在4个月和10个月时，LRP1 KO小鼠和对照组小鼠的总增殖细胞数量相似。同样，在对照组和LRP1 KO小鼠中，增殖细胞数量随年龄减少，这与其他人观察到的神经发生中与年龄相关的减少一致。鉴于海马总增殖细胞数量较少，组织学结果可能因样本量不足而无法检测到增殖差异。因此，我们还进行了流式细胞术，作为一种替代的、可能更敏感的方法来测量增殖细胞。除了tdTomato和EdU，我们使用了活/死染色试剂盒，并标记了CD133，一种细胞表面神经前体标志物，以排除星形胶质前体细胞的污染。使用流式细胞术，我们发现4月龄时，对照组和LRP1 KO小鼠的增殖和非增殖细胞比例相似。相反，到10月龄时，我们观察到LRP1 KO小鼠中增殖细胞与非增殖细胞的比例增加。
接下来，我们测试是否可以测量到细胞死亡的任何差异，因为许多未成熟细胞类型，包括Ⅱ型和Ⅲ型前体细胞，会经历凋亡，这是神经发生的正常部分。为了测量海马中经历程序性细胞死亡的Ⅱb型和Ⅲ型细胞数量，我们进行了TUNEL和DCX共标记。我们首先在经历高架十字迷宫行为测试后采集的小鼠中进行了这项分析。在tdTomato阳性、DCX阴性细胞中，我们发现4月龄时，与对照组小鼠相比，LRP1 KO小鼠的TUNEL阳性细胞百分比降低，而这些差异在10月龄时不再明显，可能是因为此时对照组小鼠发生凋亡的细胞百分比已经降低，而LRP1 KO小鼠的百分比保持一致。在tdTomato阳性、DCX阳性的假定Ⅱb/Ⅲ型细胞中，我们在两个时间点均未观察到LRP1 KO小鼠和对照组小鼠之间TUNEL的差异。在tdTomato阴性细胞（非神经元细胞）群体中，LRP1 KO小鼠的总TUNEL随年龄增加，但在4个月或10个月时，其水平与对照组小鼠无显著差异。我们使用未在巴恩斯迷宫或高架十字迷宫中花费时间的新的4月龄小鼠重复了我们的分析，有趣的是，在tdTomato阳性、DCX阴性细胞群体中，我们没有观察到对照组小鼠和LRP1 KO小鼠之间TUNEL的显著差异。
4. 讨论
总之，我们的数据表明，成年NSC中缺乏LRP1会损害10月龄LRP1 KO小鼠的海马空间记忆和工作记忆，并增加焦虑样行为。没有LRP1的成年新生神经元显示出升高的成熟标志物，同时伴有树突复杂性降低。LRP1缺失还导致增殖增加和细胞死亡减少。综上所述，我们的结果证明了LRP1在成年海马神经发生中的重要性——其意义可能超越学习和记忆的基本生物学，延伸至神经退行性疾病和其他疾病相关的记忆和行为缺陷。
迄今为止，尚无研究探讨LRP1在成年海马NSC中的重要性。我们是首个发现LRP1在调节海马NSC生物学中发挥重要作用的研究。值得注意的是我们在巴恩斯迷宫测试中识别的行为表型。训练一周后，LRP1 KO小鼠显示出明确目标洞识别的丧失，但保留了识别目标象限的能力。这表明模式分离能力丧失——即识别相似但
