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本文是一项比较性表观遗传学研究，聚焦于脑部恶性肿瘤黑色素瘤脑转移（MBM）与胶质母细胞瘤（GB）。研究发现，尽管二者在肿瘤起源和MGMT（O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶）启动子甲基化与蛋白表达的L形关系上存在共性，但在MGMT启动子、基因间增强子（enhancer）甲基化水平以及与患者总生存期（Overall Survival, OS）的关联强度上存在显著差异。该研究揭示了在神经外胚层起源的脑肿瘤中，MGMT的表观遗传调控既存在保守机制，也表现出肿瘤特异性的演变路径，强调了靶向甲基化调控在肿瘤生物学和治疗中的复杂性。
1. 引言
癌症相关死亡多由转移灶，而非原发性肿瘤导致。越来越多的证据表明，DNA甲基化改变对于诱导癌细胞产生可塑性表型以适应转移微环境至关重要。脑转移（Brain Metastases, BM）最常见来源于肺、乳腺、肾或黑色素瘤，是最常见也最致命的脑肿瘤之一。胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GB）和黑色素瘤脑转移（Melanoma Brain Metastasis, MBM）均源于神经外胚层谱系，共享大脑这一组织环境，但其表观遗传调控尚不明确。
本研究旨在探索MBM和GB之间共享和独特的DNA甲基化模式。我们采用靶向方法，聚焦于MGMT（O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶）调控元件的甲基化。MGMT是一种DNA修复蛋白，能够移除细胞毒性损伤O6-甲基鸟嘌呤。在GB中，MGMT启动子甲基化是预测其对烷化剂药物替莫唑胺（TMZ）治疗反应的生物标志物，但在MBM患者中，TMZ疗效不佳，MGMT启动子甲基化作为预测性生物标志物的相关性仍存在争议。除了MGMT调控元件的甲基化，本研究也分析了长散布核元件-1（Long Interspersed Nuclear Element-1, LINE-1）的甲基化，作为评估全基因组DNA甲基化的替代标志物。
2. 材料与方法
本研究获得了伦理委员会批准。MBM样本来源于神经外科手术，所有分析均在从手术切除转移灶建立的永生化细胞系上进行。通过焦磷酸测序对MGMT启动子的12个CpG位点、9个增强子（包括基因间增强子A-E和基因内增强子F-I）的99个CpG位点以及LINE-1的5个CpG位点进行DNA甲基化分析。数据分析使用R软件完成。
3. 结果
3.1. MGMT启动子、基因间和基因内增强子的甲基化水平
在分析的20个MBM样本中，55.0%的样本MGMT启动子发生甲基化。基因内CpG的甲基化水平显著高于基因间CpG。基因间和基因内增强子在MGMT启动子未甲基化的样本中，其甲基化程度均高于启动子已甲基化的样本。我们发现增强子之间存在共甲基化模式，其中增强子B和E聚为一类，增强子A、F、G、H和I聚为另一类。
与GB相比，MBM在所有分析的调控元件中均表现出更低的甲基化水平。这种差异在启动子和基因间增强子A-C、E中最为显著。在与独立原发黑色素瘤样本比较时，MBM在大多数MGMT增强子中显示出较低的甲基化水平，但在基因间增强子D和MGMT启动子中观察到更高的甲基化。
3.2. 全基因组DNA甲基化
通过分析LINE-1甲基化水平发现，MBM的全基因组DNA甲基化水平显著低于GB，表明MBM的全局表观遗传改变更为显著。但与独立原发黑色素瘤队列相比，MBM的LINE-1甲基化水平更高。
3.3. 增强子甲基化与CpG位置的关系
在MBM和GB中，位于基因间增强子5'端的CpG比位于3'端的CpG甲基化程度更高。而在MBM的基因内增强子中观察到相反的趋势，位于3'端的CpG甲基化程度更高，特别是在启动子未甲基化的样本中。这表明CpG的相对位置可能影响增强子独特的甲基化模式。
3.4. MGMT启动子与增强子甲基化的关联
在MBM中，启动子CpG之间以及基因内增强子CpG之间的甲基化水平呈强正相关，而启动子与基因内增强子甲基化水平呈负相关。基因间增强子CpG之间的甲基化也呈正相关，但关联较弱。启动子与基因内增强子甲基化水平之间的负相关性是MBM和GB共有的特征。相比之下，涉及基因间增强子（特别是增强子D）的关联更多是MBM特有的。
3.5. MGMT启动子与增强子甲基化同MGMT蛋白表达的关联
在MBM中，mRNA和蛋白表达之间没有线性相关性。启动子CpG的甲基化与蛋白表达呈L形关系，表明MGMT仅在启动子未甲基化的情况下表达。相反，多个基因内增强子CpG与蛋白表达呈倒L形关系，即低水平的增强子甲基化与MGMT表达缺失相关。表达MGMT蛋白的MBM样本，其基因内增强子甲基化水平显著高于不表达的样本，而基因间增强子差异不大。这些L形和倒L形关系，以及增强子甲基化在启动子已甲基化肿瘤中更高的现象，在GB中也观察到。MGMT蛋白表达样本特有的显著差异仅见于GB。
3.6. MGMT启动子与增强子甲基化同TERT启动子变体的关联
研究发现，MBM中基因间增强子B、E（在启动子未甲基化样本中）以及基因内增强子F、G（在启动子已甲基化样本中）的多个CpG位点甲基化水平与TERT SNP rs2853669的基因型（TT vs CT）存在显著关联。在GB中，rs2853669基因型差异主要与基因间增强子B、C、D的甲基化相关。在MBM和GB中，均未观察到MGMT启动子或增强子甲基化与TERT启动子突变C228T和C250T存在关联。
3.7. MGMT启动子与增强子甲基化同总生存期的关联
在MBM中，只有启动子（CpG 72和76）和基因间增强子B（CpG 12和17）的甲基化与总生存期（OS）存在显著关联，且仅在排除一个长期生存的离群值患者后显著。这些结果提示，较低的启动子甲基化或较高的增强子B甲基化可能为MBM患者带来生存获益。在GB中，所有12个分析的启动子CpG以及基因内增强子F和G中的多个CpG均与OS显著相关，但与MBM相反，较高的启动子甲基化和较低的增强子甲基化与改善的生存期相关。
3.8. MGMT启动子与增强子甲基化同年龄和性别的关联
在MBM中，年龄小于60岁患者的样本在基因间增强子C的1个CpG位点（未分层样本）和基因内增强子G的3个CpG位点（启动子未甲基化样本）表现出更高的甲基化水平。女性患者在多个启动子CpG位点的甲基化水平显著高于男性，而在基因内增强子G的两个CpG位点则显著低于男性。在GB中也检测到与年龄和性别相关的显著甲基化差异，但涉及的CpG位点与MBM不同。
4. 讨论
研究表明，大脑微环境对转移灶的甲基化组有强烈影响。由于共同的发育起源和共享的大脑组织环境，MBM和GB可能表现出相似的表观遗传特征。本研究发现，两种肿瘤类型中MGMT启动子甲基化样本的比例几乎相同（MBM 55.0% vs. GB 55.9%）。在两种肿瘤中，启动子甲基化与MGMT表达的关系均呈L形模式，但该关系在MBM中似乎不那么严格。与GB相比，MBM在所有分析的调控元件中均表现出更低的甲基化水平，尤其是在基因间增强子中差异更为显著。
增强子甲基化在MBM的MGMT调控中发挥作用。在MBM和GB中，基因内增强子甲基化水平呈强正相关，且与启动子甲基化呈负相关。有趣的是，涉及增强子D的关联主要是MBM特有的。在两种脑部恶性肿瘤中，基因内增强子甲基化与启动子甲基化紧密相连，并且几乎在所有靶向的基因内增强子CpG位点，表达MGMT的样本甲基化水平都高于不表达的样本。与启动子甲基化不同，基因内增强子甲基化与MGMT表达呈倒L形关联。
研究发现，TERT启动子突变在MBM和GB中均常见，但均与MGMT启动子或增强子甲基化无关。然而，TERT SNP rs2853669的基因型与增强子甲基化相关。在MBM和GB中，MGMT启动子和增强子甲基化均与OS相关，但在GB中的关联更为一致和广泛。在两种肿瘤类型中，仅发现有限数量的CpG位点与患者年龄相关。性别特异性差异在多个CpG位点被观察到，表明性别特异性的表观遗传调控可能有助于脑部恶性肿瘤中观察到的甲基化-表达关系的异质性。MBM的全基因组DNA甲基化水平显著低于GB，但高于原发黑色素瘤样本。
5. 结论
本研究结果揭示了MBM和GB在MGMT调控上共享和肿瘤特异性的特征。增强子甲基化与启动子甲基化、MGMT表达以及临床和人口统计学参数密切相关，突显了脑部恶性肿瘤中表观遗传调控的复杂性。虽然一些甲基化-表达关系在不同肿瘤类型中是保守的，但其他方面可能反映了肿瘤特异性的生物学或临床行为。本研究的一个关键优势是在同一机构内对MBM和GB队列使用了相同的方法，最大限度地减少了技术差异，确保观察到的差异反映了真实的生物学区别。
