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本文综述了长牡蛎（Crassostrea gigas）在弧菌（Vibrio splendidus）刺激下，通过免疫启动（immune priming）实现先天免疫增强的分子机制。研究聚焦于微小RNA（miRNA）在血细胞介导的免疫启动中的关键调控作用，首次系统鉴定了在初次和二次刺激中差异表达的miRNA谱，并通过功能实验揭示Cgi-miR-1175-P6/P7-y通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK6/14）和清道夫受体（SCARF2）等基因，负向调控血细胞增殖，从而影响免疫应答强度。该研究为无脊椎动物免疫记忆的转录后调控提供了新见解，并为水产养殖病害防控策略的开发奠定了理论基础。
引言
长牡蛎是中国重要的水产养殖物种，但病原感染导致的疾病爆发严重制约了产业发展。其中，弧菌（Vibrio splendidus）是主要病原之一，可引起高达65–85%的死亡率。先天免疫系统在反复病原攻击时可启动增强的防御反应，这被称为无脊椎动物的免疫启动（immune priming）或脊椎动物的训练免疫（trained immunity）。尽管对软体动物免疫启动的研究已取得进展，但其分子机制和时间免疫动态仍存在很大差异。表观遗传重编程，尤其是微小RNA（miRNA）介导的调控，在先天免疫记忆建立中起着关键作用。作为重要的转录后调控因子，miRNA通过动态靶向基因来协调免疫应答。细胞增殖增加是大多数无脊椎动物免疫启动的一个特征。在牡蛎中，预灭活弧菌启动后，二次刺激6小时可检测到总血细胞计数（THC）和新生成的循环血细胞显著增加。虽然组蛋白修饰（如H3K4me3）在牡蛎免疫启动中的作用已被认识，但转录后调控机制的作用仍不清楚。鉴于miRNA在训练免疫的表观遗传重编程中的关键作用，miRNA在免疫激活细胞中的调控作用可能是阐明牡蛎增强免疫应答机制不可或缺的部分。
材料与方法
为阐明以血细胞计数升高为特征的免疫启动的潜在分子机制，对血细胞进行了miRNA转录组测序。将牡蛎随机分为四组：SS（两次无菌海水注射）、SV（首次无菌海水，二次活弧菌）、VS（首次热灭活弧菌，二次无菌海水）和VV（两次弧菌刺激）。在二次刺激后6小时收集血细胞，提取RNA并构建小RNA文库进行测序。使用edgeR鉴定差异表达（DE）的miRNA（阈值：倍数变化≥2，p<0.05）。通过Mfuzz进行聚类分析，并利用miRanda、TargetScan和RNAhybrid预测靶基因。KEGG富集分析用于探索靶基因的潜在通路。通过体内功能获得/缺失实验验证关键miRNA（Cgi-miR-1175-P6/P7-y）的功能，使用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）标记和流式细胞术分析血细胞增殖，并通过定量实时PCR（qRT-PCR）检测基因表达。
结果
1. miRNA鉴定与表达谱
测序共获得1.1513亿条高质量 reads，鉴定出694个miRNA（51个已知、360个MirGeneDB已知和283个新miRNA）。所有已知、已知和新miRNA在第一个核苷酸位置均观察到显著的U偏好性。基于TPM值的聚类热图显示了这些miRNA在四组中的表达模式，Mfuzz聚类分析进一步将其分为12个具有协调表达模式的簇。
2. 参与初次和二次免疫应答的差异表达miRNA
在SS与SV（初次刺激）的比较中，共鉴定出470个DE miRNA，其中115个上调，212个下调。在VS与VV（二次刺激）的比较中，共鉴定出210个DE miRNA，其中107个上调，103个下调。值得注意的是，有67个miRNA在初次和二次刺激中均差异表达。这些miRNA根据表达模式分为6个模块（模块1-6）。其中，模块5中的三个DE miRNA（Cgi-miR-1175-P6-y、Cgi-miR-1175-P7-y和novel-0095-3p）在二次刺激时表达量低于初次应答，而模块6中的novel-m0074-5p和novel-m0270-5p在二次刺激时表达量更高。模块5和6中的DE miRNA被推测具有增强免疫应答的作用。qRT-PCR验证了其中8个DE miRNA的表达，证实了测序数据的高可靠性。
3. DE miRNA靶基因的KEGG富集分析
对推测的免疫增强DE miRNA（模块5和6）和潜在的免疫记忆相关DE miRNA（模块2和3）的靶基因进行KEGG富集分析。模块5的靶基因在细胞增殖相关信号通路（如ErbB和Wnt信号）和代谢重编程通路（如碳水化合物消化吸收、糖酵解/糖异生和胰岛素抵抗）中显著富集。模块5也在免疫相关信号通路（如AGE-RAGE、趋化因子信号通路和Fc epsilon RI信号通路）中富集。模块6的miRNA主要富集于神经内分泌和神经递质相关通路，包括5-羟色胺能突触、皮质醇合成与分泌、甲状腺激素合成和雌激素信号通路。潜在的免疫记忆相关DE miRNA（模块2和3）也与神经内分泌（5-羟色胺能突触、皮质醇合成与分泌、谷氨酸能突触和库欣综合征）以及细胞间通讯（如长期抑郁和间隙连接通路）相关。这些发现揭示了miRNA模块之间的分工，模块5驱动免疫激活，而模块2、3和6则支持系统免疫稳态。
4. 推测的免疫增强DE miRNA靶向细胞增殖、代谢和免疫应答相关基因
进一步研究了模块5和6中miRNA的靶基因。表达量在二次刺激时显著降低的Cgi-miR-1175-P6/P7-y，可能通过解除对多种模式识别受体（PRR）、细胞周期相关基因和糖酵解相关基因（包括SCARF1/2、CDK6/14、己糖激酶2（HK2）和丙酮酸激酶PKM（PKM））的转录后抑制来增强免疫应答或促进细胞增殖。同时，novel-miR-0095-3p可能靶向甘露糖受体和细胞存活相关基因，如巨噬细胞甘露糖受体1（MMR1）、C型甘露糖受体2（MRC2）、凋亡抑制剂（IAP）和端粒酶蛋白成分（TEP）。此外，靶基因分析显示，novel-m0074-5p和novel-m0270-5p调节多种神经内分泌受体和神经递质转运蛋白，从而维持免疫微环境的稳态。
5. Cgi-miR-1175-P6/P7-y通过介导细胞周期蛋白依赖性激酶调控细胞增殖
由于模块5中的Cgi-miR-1175-P6/P7-y被预测靶向多个细胞增殖相关基因，进一步验证了其在牡蛎免疫启动中的生物学功能。CgCDK6、CgCDK14和CgSCARF2被鉴定为Cgi-miR-1175-P6/P7-y的推定靶基因。体内功能实验表明，注射Cgi-miR-1175-P6/P7-y模拟物（mimics）后，其表达量相对于阴性对照组上调4.37倍，而其靶基因CgCDK6、CgCDK14和CgSCARF2的mRNA表达水平则降低。弧菌刺激后，模拟物处理组的EdU+血细胞比例降至阴性对照组的0.72倍，增殖相关基因CgMyc-A、CgRunx和CgIL17-1的mRNA表达水平也分别降至0.59、0.75和0.48倍。相反，注射抑制剂（inhibitor）后，Cgi-miR-1175-P6/P7-y表达下调至阴性对照组的0.60倍，而其靶基因表达上调。抑制剂处理组的EdU+血细胞比例增加至阴性对照组的1.56倍，CgMyc-A、CgIL17-1和CgRunx的mRNA表达水平也分别增加至1.41、2.03和3.48倍。这些相互印证的结果表明，Cgi-miR-1175-P6/P7-y是牡蛎血细胞增殖的关键负调控因子。
讨论
作为分子调节器，miRNA通过精细调控基因表达来精确协调免疫应答。本研究在长牡蛎中鉴定了411个已知和283个新miRNA。在初次和二次刺激中均差异表达的67个miRNA被分为6个模块。其中，模块2和3中的潜在免疫记忆相关DE miRNA同时富集于神经内分泌和细胞间通讯通路，表明它们通过协调细胞因子产生、能量分配和细胞间通讯来维持稳态，并使牡蛎处于“预激活”的警戒状态，以应对二次刺激。模块5中的潜在免疫记忆相关DE miRNA在代谢相关通路和细胞增殖相关通路中富集，表明模块5中的DE miRNA通过协调调节代谢和细胞增殖过程来协调免疫应答。模块6中的DE miRNA富集于神经内分泌和神经递质相关通路。结果共同支持模块5中的miRNA可能通过介导细胞增殖和代谢过程来增强免疫应答，而模块2、3和6中的miRNA则通过系统性调节神经内分泌系统，调控细胞因子产生和能量分配来维持免疫稳态。
Cgi-miR-1175-P6/P7-y被预测靶向多种PRR、细胞周期相关基因和糖酵解相关基因，而novel-m0095-3p则靶向甘露糖受体和细胞存活相关基因。结果表明，Cgi-miR-1175-P6/P7-y和novel-m0095-3p可能通过靶向细胞增殖相关基因来增强循环血细胞的再生，而novel-m0074-5p和novel-m0270-5p则通过靶向神经内分泌因子调节细胞因子来维持免疫启动中的免疫稳态。
免疫启动介导的细胞增殖反应已在多种无脊椎动物中得到证实。本研究表明，Cgi-miR-1175-P6/P7-y负向调控细胞增殖。弧菌刺激后，Cgi-miR-1175-P6/P7-y表达降低可能通过解除其对CDK（CgCDK6和CgCDK14）的抑制，进而导致血细胞增殖，这一过程可能通过MYC的潜在串扰进一步调节。
结论
本研究对牡蛎免疫启动过程中的miRNA表达谱进行了全面研究。初次和二次刺激后分别有115个和107个miRNA上调，212个和103个miRNA下调。在这些DE miRNA中，Cgi-miR-1175-P6/P7-y和novel-m0095-3p可能通过介导细胞增殖和代谢过程来增强免疫应答，而模块2、3和6中的DE miRNA则通过系统性调节神经内分泌系统，调控细胞因子产生和能量分配来维持免疫稳态。功能实验证明，血细胞增殖受Cgi-miR-1175-P6/P7-y通过靶向CgCDK6、CgCDK14和CgSCARF2进行负向调控。本研究中鉴定的miRNA为推进对牡蛎免疫启动中miRNA功能的理解提供了宝贵资源。
