基于细菌熔解曲线分析（BMCA）的酸奶中乳酸菌分类、定量与耐热性评估新方法

《Frontiers in Microbiology》：Classification, quantification, and thermotolerance assessment of lactic acid bacteria in yogurt using bacterial melting curve analysis

本文综述了一种创新的细菌熔解曲线分析（BMCA）方法，该方法利用荧光染料SYTO 9和温控荧光计，通过监测乳酸菌（LAB）在升温过程中的双链DNA（dsDNA）解离与细胞膜透性变化，实现了对酸奶中多种LAB的无抗体快速分类、准确定量及耐热性评估，为益生菌产品质量控制提供了高效、便捷的新工具。

　　

引言：益生菌市场与检测挑战

随着消费者对益生菌健康益处的认识日益加深，含有益生菌的功能性食品市场迅速扩大。乳酸菌（LAB）是功能性食品应用中最主要的益生菌微生物，常被添加到酸奶等发酵乳制品中以促进胃肠道健康。为确保最佳生理效果，益生菌菌株应在产品整个货架期内保持代谢活性、物种多样性和足够的人口密度。因此，声称具有益生菌健康功效的商业产品必须通过严格的质量控制措施来证明其符合这些多样性和活性标准。

尽管存在多种分析LAB的方法，但传统的基于培养的技术由于其简单性和低成本测试而仍然是最广泛使用的方法。然而，多种LAB物种在相似条件下培养，这阻碍了通过培养方法快速准确地测定每个物种的活菌数。使用特异性引物的聚合酶链式反应（PCR）在定性和定量测定LAB方面越来越受欢迎，但不幸的是无法区分死菌和活菌。用于表征LAB的新兴技术包括流式细胞术、16S rRNA基因测序、表面增强拉曼散射、质谱、比色分析和宏基因组学等。这些技术通常需要大型设备、高成本试剂、训练有素的操作人员或较长的测试时间。此外，它们中很少有能同时实现对多种LAB的分类和定量。

方法原理：细菌熔解曲线分析（BMCA）的建立

本研究首次提出了一种细菌熔解曲线分析（BMCA）方法，用于快速分类乳酸菌。该方法使用SYTO 9荧光染料和温控荧光计，同时监测LAB的活力和双链DNA（dsDNA）含量。SYTO 9是一种靶向dsDNA的荧光染料，在未结合状态下荧光较弱，结合dsDNA后发出强荧光。作为一种生物膜渗透性染料，SYTO 9也广泛用于细菌的dsDNA染色。本研究发现，尽管SYTO 9对LAB的存活状态表现出非歧视性染色，但由于细胞膜屏障功能受损，显著的荧光增强仅发生在死LAB细胞中。这种特性使得SYTO 9可用于同时追踪LAB的活力（通过生物膜完整性）和dsDNA含量。

基于不同LAB物种在耐热性和基因组组成方面存在的显著种间差异，研究人员进一步将SYTO 9与温控荧光计结合，建立了用于LAB分类的BMCA方法。该方法的工作原理是：将SYTO 9与LAB细胞共孵育。当温度从生理温度（37°C）升高到变性温度（98°C）时，渐进性的膜破坏导致LAB细胞死亡，促进了SYTO 9流入细胞并增强荧光强度。然而，进一步加热会导致细菌基因组dsDNA逐渐变性，引起荧光信号的后续下降。不同LAB菌株在热稳定性和dsDNA组成方面的差异，使得通过分析熔解曲线并使用多维因子降维技术能够区分它们。同时，可以从熔解曲线的导数中捕获三个特征温度值：半致死温度（T_s）、全致死温度（T_d）和DNA熔解温度（T_m），用于评估LAB菌株的耐热性。

结果与讨论

1. SYTO 9对不同活力乳酸菌的选择性

研究以嗜热链球菌（S. thermophilus）、保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus）和干酪乳杆菌（L. casei）为模型，系统研究了SYTO 9对活菌和死菌的选择性。这三种LAB菌株是中国乳制品行业应用最广泛的。荧光光谱、流式细胞术（FCM）定量分析和荧光显微镜半定量观察结果一致表明，对于所有三种LAB菌株，死菌细胞都出现了更显著的荧光增强。其中，L. casei的死菌与活菌在520 nm处的荧光强度差异最大。这表明，虽然SYTO 9对LAB的活力状态表现出非歧视性染色，但由于受损的细胞膜屏障功能，显著的荧光增强仅发生在死LAB细胞中。

2. 物种特异性细菌熔解曲线的形成：两个连续的热转变

对LAB样品进行BMCA分析发现，其温度响应性荧光谱与传统的dsDNA熔解曲线明显不同。标准dsDNA分析显示荧光随温度升高而单调减少，而我们的LAB模型表现出双相行为：初始的荧光增强阶段（37–68°C）和随后的信号衰减阶段。这种独特的模式归因于两个连续的热转变：生物膜透化阶段和dsDNA变性阶段。在生物膜透化阶段（37–68°C），渐进的生物膜破坏促进了SYTO 9渗透到LAB细胞中，放大了荧光。在dsDNA变性阶段（>68°C），随后的加热熔解了无活力细胞中的染色体DNA，导致dsDNA转变为单链DNA（ssDNA）时荧光下降。这两个连续的热转变共同塑造了活LAB的熔解曲线。

对熔解曲线的导数分析可以识别三个特征温度：半致死温度（T_s）、全致死温度（T_d）和DNA熔解温度（T_m）。研究认为，在T_s点，约50%的LAB细胞死亡；在T_d点，所有LAB细胞都已死亡。当温度继续上升到T_m点时，约50%的dsDNA会解链。平板培养结果进一步证实了这两个连续的热转变。这种复合“熔解曲线”同时报告了细胞膜完整性丧失（LAB死亡）和核酸变性，为LAB分类提供了多参数热特征签名。

9?CFU/mL. (b,c) Normalization (b) and derivation (c) of the FL reporter for the above samples. (d) Melting curves for dead S. thermophilus of different concentrations. (e–h) Melting curves for repeated experiments of live S. thermophilus of different concentrations. (i) Statistic analysis of semi-lethal temperature (Ts), total lethal temperature (Td), and DNA melting temperature (Tm) of the above samples. Five independent experiments were conducted, and data are represented as mean?±?SD (n?=?5). The difference was significant, as indicated by three asterisks for p?

3. 通过熔解曲线的多元降维进行乳酸菌分类

为了区分不同的LAB菌株，从熔解曲线中提取T_s, T_d, 和T_m并绘制三维散点图，可以清楚地区分嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌这三种LAB菌株。然而，缺少三个参数中的任何一个都无法对这些LAB进行分类，这表明生物膜透化阶段和dsDNA变性阶段对于LAB分类都是绝对必要的。更简单的方法是，熔解曲线可以通过多元降维直接转换为二维散点图。应用了主成分分析（PCA）、核主成分分析（KPCA，Cosin和RBF核）、线性判别分析（LDA）和t分布随机邻域嵌入（T-SNE）等算法进行降维。降维后的可视化结果显示了代表不同LAB菌株的数据点之间有明确的空间分离。比较评估显示，t-SNE在实现三种LAB菌株之间的完全区分方面表现优异。因此，该算法被选用于后续的熔解曲线模式分析和LAB分类。

4. 乳酸菌的同时定量与分类

为了模拟酸奶成分，将超高温灭菌（UHT）牛奶接种三种代表性LAB菌株：嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌。这种三菌株组合因其在中国酸奶产品中的普遍性而被选为模型系统。研究首先评估了该方法同时定量和区分LAB的能力。单细胞来源的LAB悬浮液通过BMCA进行分析。降维后的散点图显示了四个不同的簇：一个对照组和三个菌株特异性种群。在固定体积内，LAB阳性信号与加标浓度之间存在线性关系，从而可以通过将细胞计数按样品体积缩放来进行直接定量。与平板计数的方法验证表明两者有很强的一致性（R²= 0.9914）。

所开发的基于BMCA的方法进一步用于测试市售酸奶中LAB的定量和分类。根据中国国家标准（GB 19302-2010），声称的活LAB计数应高于1 × 10⁶CFU/mL。为了评估这些声称，该研究应用BMCA技术来定量和鉴定市售样品中的LAB。对于经过灭菌的酸奶，未检测到活LAB细胞。在声称含有活性干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的酸奶中，BMCA确实鉴定出了这三种LAB菌株。研究人员进一步比较了四种不同品牌（NO1, NO2, NO3, NO4）的酸奶。它们都声称含有上述三种活LAB菌株。虽然四种酸奶的总LAB在8 × 10⁷到 20 × 10⁷CFU/mL之间变化，但都符合≥1 × 10⁶CFU/mL的标准。不同品牌间的种间比例也存在显著差异。例如，在NO3酸奶中，嗜热链球菌最为丰富，而在其他酸奶中，干酪乳杆菌的含量相对较高。此外，研究发现NO3酸奶中的活保加利亚乳杆菌（2 × 10⁵CFU/mL）低于标准，因此其声称含有功能性活保加利亚乳杆菌的说法值得商榷。

5?CFU/mL. (e–g) Representative scatter plot after dimension reduction of the melting curves for UHT milk samples spiked with LAB of different inter-species ratios. The total LAB was 1?×?10⁴?CFU/mL, with S. thermophilus ratio ranging from 1 to 100%. (h) The relationship between the detected LAB ratio and theoretical ratio. (i) Pretreatment of the yogurt samples. (j) Quantification and classification of the LAB in sterilized yogurt. (k) Quantification and classification of the LAB in yogurt (NO1 sample) claimed to have live LAB. (l) Comparison in S. thermophilus, L. bulgaricus, and L. casei counts between different yogurt bands. Five independent experiments were conducted, and data are represented as mean?±?SD (n?=?5). The difference was significant, as indicated by one asterisk for p?

5. 使用BMCA评估活乳酸菌的耐热性

大多数LAB菌株对温度变化敏感，需要在储存期间冷藏以保持LAB活性，这大大增加了物流和保存成本。最近的尝试通过封装或表面修饰策略来增强益生菌的抗逆性。本研究使用BMCA捕获其特征温度，比较评估了不同配方中LAB的耐热性。使用可食用的海藻酸钙来制备封装化的LAB。单独的海藻酸钠或氯化钙都不能改变所测试LAB的熔解曲线，所有特征温度在不同浓度的海藻酸钠和氯化钙中都是一致的，表明它们对LAB的耐热性没有影响。然而，当海藻酸钠和氯化钙结合将LAB封装到海藻酸钙凝胶中时，被封装的LAB在特征温度上发生了偏移。嵌入海藻酸钙中的LAB的T_s和T_d值都高于游离LAB。因此，海藻酸钙凝胶可以作为热屏障来提高LAB的耐热性。

结论

益生菌发酵食品市场的扩大需要先进的方法来验证产品声称。在本研究中，我们发现作为dsDNA特异性染料的SYTO 9更倾向于渗透死LAB。基于此，我们建立了一种用于快速分类LAB的BMCA方法。在该方法中，SYTO 9与温控荧光计结合使用，以同时追踪LAB活力和dsDNA的动态变化，绘制物种特异性的熔解曲线。该曲线归因于两个连续的热转变：生物膜透化阶段和dsDNA变性阶段。在第一个阶段，渐进的生物膜破坏促进了SYTO 9渗透到LAB细胞中，增加了荧光。在第二个阶段，随后的加热熔解了无活力细胞中的dsDNA，导致dsDNA转变为ssDNA时荧光下降。通过熔解曲线的多元降维，明确区分了三种模型LAB。这种新方法有效地实现了对酸奶样品中LAB的鉴定和测量，而无需基于抗体的技术。然而，BMCA仅在三种相对容易培养的LAB菌株上进行，而工业应用中使用的LAB有超过100种。我们预计未来的研究将侧重于为LAB建立一个标准化的细菌熔解曲线库。通过查询这个库，BMCA方法可以应用于鉴定任何LAB产品中的物种，包括药品、酸奶和益生菌制剂。此外，BMCA方法也可用于评估配方中LAB的热稳定性。