普魯士藍負載鉑納米顆粒：pH 普適的過氧化氫酶模擬物，構建穩健的 VEGF 化學發光免疫檢測新技術

《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Prussian blue-supported platinum nanoparticles as pH-Universal catalase mimics: enabling robust chemiluminescent immunoassay for VEGF in clinical diagnostics

本研究開發了一種基於普魯士藍負載鉑納米粒子（PB@Pt）的新型納米酶，該材料表現出廣泛pH範圍內的強效過氧化氫酶（CAT）模擬活性，特別是在鹼性條件下。其可高效催化魯米諾-H2O2化學發光（CL）反應，性能超越天然辣根過氧化物酶（HRP）。基於此，研究者構建了一種新型化學發光免疫檢測方法，用於血管內皮生長因子（VEGF）的高靈敏、高特異性定量檢測，展現了優異的臨床應用潛力，為開發基於納米酶的高性能檢測平台提供了新策略。

　　

納米酶（Nanozymes）作為一類具有類似酶活性的納米材料，以其高催化活性、優異穩定性和低成本等優勢，成為天然酶在化學發光免疫分析（CLIA）中的潛在替代品。傳統的天然酶，如辣根過氧化物酶（HRP），在應用中存在局限性，其最適pH（約6.0-6.5）與魯米諾（luminol）化學發光反應的最佳pH（約11）不匹配，導致信號效率降低。此外，天然酶還面臨易變性、穩定性差和成本高等問題。因此，開發能在鹼性環境中保持高活性的納米酶對於優化基於魯米諾-H₂O₂的化學發光檢測系統至關重要。

在眾多納米酶中，鉑納米顆粒（PtNPs）因其多功能性和高催化效率而備受關注，尤其是在中性及鹼性條件下展現出顯著的過氧化氫酶（CAT）模擬活性。然而，小尺寸的PtNPs容易因高表面能而聚集，導致活性位點減少和催化活性下降。為了解決這一問題，將PtNPs負載在穩定的基底材料上是一種有效策略。普魯士藍（PB）納米顆粒因其良好的生物相容性、高化學穩定性和易製備性，成為PtNPs的理想載體。PB本身也表現出CAT、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）等多種酶模擬活性，但其在化學發光免疫分析中的潛力尚未被充分發掘。

本研究通過水熱法合成了PB納米立方體，然後通過還原法在其表面原位生長PtNPs，成功製備了普魯士藍負載鉑納米粒子（PB@Pt）。表徵結果顯示，合成的PB@Pt保留了PB的立方體結構，但表面更為粗糙，粒徑從135 nm增大到170 nm。透射電鏡圖像顯示，超小的PtNPs均勻分佈在PB表面，沒有形成孤立的納米顆粒。元素分佈和X射線衍射譜證實了Pt的成功負載以及PB晶體結構的保持。

酶活性研究證實，PB@Pt在弱酸性、中性和鹼性條件下均表現出CAT模擬活性，可催化H₂O₂分解產生O₂，其活性顯著高於單純的PB。電子順磁共振（EPR）譜進一步確認，在PB@Pt催化的H₂O₂分解過程中產生了超氧陰離子自由基（O₂^•-）、羥基自由基（HO•）和單線態氧（¹O₂），這些活性氧物種（ROS）是驅動化學發光信號放大的關鍵。研究還發現，當合成中添加50 mg K₂PtCl₆時，所得的PB@Pt（PB@Pt50）表現出最高的CAT模擬活性，因此後續實驗選用該材料。

在化學發光性能評估中，研究者在不同pH條件下比較了PB@Pt和天然HRP對魯米諾-H₂O₂體系的催化效果。結果顯示，HRP在pH 8時催化活性最強，而PB@Pt在pH 9-11的寬範圍內均表現出良好的催化活性，並在pH 10時達到峰值。特別是在pH 10這一更適合魯米諾-H₂O₂系統的條件下，PB@Pt的催化性能顯著優於HRP。這表明PB@Pt能夠更好地匹配化學發光反應的最佳pH環境，解決了傳統HRP與魯米諾體系間的pH不兼容問題。

基於PB@Pt的優異性能，研究團隊構建了用於檢測血管內皮生長因子（VEGF）的“三明治”型化學發光免疫傳感器。首先，將VEGF捕獲抗體（Ab₁）包被在96孔板上。然後，將樣品與信號探針PB@Pt-Ab₂（PB@Pt與檢測抗體Ab₂的複合物）共同孵育，形成“捕獲抗體-抗原-VEGF-檢測抗體/PB@Pt”免疫複合物。洗滌後，加入魯米諾和H₂O₂底物，PB@Pt催化產生化學發光信號，其強度與VEGF濃度相關。紫外-可見光譜證實了Ab₂成功連接在PB@Pt上，形成PB@Pt-Ab₂信號探針，且該探針保留了大部分催化活性。

研究系統優化了檢測條件，包括魯米諾濃度、H₂O₂濃度、孵育時間和溫度。結果確定了最佳條件為：魯米諾濃度3.0 mM，H₂O₂濃度7.5 mM，孵育時間60分鐘，孵育溫度37°C。

在優化條件下，該化學發光免疫傳感器對VEGF表現出優異的分析性能。在5-200 pg mL^-1和200-2300 pg mL^-1兩個濃度範圍內，化學發光信號強度與VEGF濃度呈現良好的線性關係，檢測限低至5 pg mL^-1(信噪比S/N = 3)。與已報道的多種VEGF檢測方法相比，該方法具有更低的檢測限和更寬的線性範圍。

特異性測試結果顯示，對於血小板衍生生長因子（PDGF）、轉化生長因子-β（TGF-β）、人血清白蛋白（HSA）等潛在干擾物，該傳感器均未產生明顯的信號響應，僅對VEGF產生強烈的化學發光信號，證明了其高特異性。重現性和穩定性評估表明，該傳感器在日內和日間的相對標準偏差（RSD）分別為4.32%和5.79%，顯示出良好的重現性和穩定性。PB@Pt-Ab₂在4°C下儲存5天后，活性保留率超過90%，具備實際應用所需的操作和短期儲存穩定性。

為驗證臨床應用潛力，研究人員使用該傳感器檢測了五份人血清樣本中的VEGF濃度，並與商用VEGF檢測試劑盒的結果進行對比。兩種方法的檢測結果無顯著性差異，證明了該基於PB@Pt的化學發光免疫傳感器在實際樣本檢測中的準確性和可靠性。

總之，本研究成功製備了具有廣泛pH適應性的高活性CAT模擬納米酶PB@Pt。PB的多孔立方結構不僅提供了更多的活性位點，其大比表面積也穩定了PtNPs的成核與生長，防止了其聚集。PtNPs與PB的協同效應賦予了PB@Pt在弱酸性、中性和鹼性條件下均穩健的CAT模擬活性，並在鹼性條件下對魯米諾-H₂O₂體系的催化能力顯著超越天然HRP。其催化活性源於獨特的核殼協同效應：PB不僅作為穩定PtNPs的載體，其Fe³⁺/Fe²⁺氧化還原對構成了高效的“電子穿梭”系統，加速整個催化循環；PtNPs的催化功能則表現出pH響應性，在酸性條件下類似過氧化物酶（POD），在中性及鹼性條件下則切換為CAT樣活性。基於PB@Pt構建的VEGF化學發光免疫傳感器展現了高靈敏度、高特異性、寬線性範圍和良好的穩定性。這項工作不僅克服了HRP與魯米諾化學發光反應條件不兼容的難題，也拓展了CAT模擬納米酶在化學發光檢測中的應用，為開發用於臨床生物標誌物檢測的高靈敏度納米酶基化學發光系統奠定了基礎。