《Frontiers in Bioinformatics》：Integrating trajectory inference and self-explainable predictive models to explore cell state transitions in breast cancer at single-cell resolution
编辑推荐：
本文通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）对浸润性导管乳腺癌样本进行分析，整合了伪时间（pseudotime）轨迹推断与可解释的分类决策树模型。该研究不仅表征了肿瘤微环境（TME）中的异质性细胞群，还深入揭示了细胞状态转变（如上皮-间质转化EMT）过程中的关键驱动基因及其表达阈值，为理解肿瘤进展的分子机制、发现新的预后标志物和潜在治疗靶点提供了透明、可解释的分析框架。
本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对一份人浸润性导管乳腺癌样本进行了深度分析，旨在从单细胞分辨率解析肿瘤及其微环境的异质性，并探索驱动细胞状态动态转变的关键分子。
数据生成与质量控制
研究首先从一个48岁女性患者的浸润性导管癌组织中制备了单细胞悬液，并使用10X Genomics Chromium平台构建了单细胞转录组文库。在数据预处理阶段，经过严格的质量控制（Quality Control, QC），包括过滤低质量细胞、去除高线粒体基因占比的细胞以及检测和移除潜在的多重体，最终保留了5,834个高质量细胞和11,747个基因用于下游分析。
细胞类型鉴定与肿瘤微环境（TME）解析
通过对高质量单细胞转录组进行无监督聚类，研究共识别出六个转录组学上不同的细胞簇。利用已知的标记基因和自动化工具SCSA进行细胞类型注释，这些细胞簇被分别鉴定为：干细胞（Cluster 0, 3,006个细胞）、S100A8/A9高表达炎症/应激细胞（Cluster 1, 1,522个细胞）、上皮细胞（Cluster 2, 649个细胞）、间充质干细胞（Cluster 3和4，分别为484个和139个细胞），以及一个身份不明确的“未知”细胞群（Cluster 5, 34个细胞）。干细胞高表达MYC、CD44、EPCAM、ITGA6和TP63等干性标志物。上皮细胞则特异性表达CDH1、CLDN1、MUC1、KRT7和OCLN，这些基因是维持上皮细胞完整性和极性的关键。相反，间充质细胞的特征是表达FN1、S100A4、VIM、COL1A1/2和FAP等与细胞外基质（ECM）重塑和上皮-间质转化（EMT）相关的基因。
重构细胞分化轨迹
为了探索细胞状态的动态演变，研究采用了基于图的伪时间轨迹推断方法，即分区图抽象（Partition-based Graph Abstraction, PAGA）。分析将身份明确的Cluster 0、2、3、4纳入计算，并将干细胞（Cluster 0）设定为轨迹的起点（根节点）。结果显示，存在一条清晰的从干细胞到上皮细胞，再进一步分化为两个间充质细胞亚群（Cluster 3和4）的进展路径。这一发现证实，EMT在乳腺癌中并非简单的二元开关，而是一个包含多种中间状态的、连续而复杂的渐变过程。
关联轨迹与基因洞察的可解释机器学习
研究的核心创新在于将轨迹推断结果与可解释的决策树模型相结合，以揭示驱动细胞状态转变的具体基因及其表达阈值。研究首先训练了一个包含所有细胞簇的全局分类决策树模型，其根节点分裂基因为OSTC，表明该基因在区分最广泛的细胞状态中起着核心作用，模型整体准确率达到82%。
更重要的是，研究根据伪时间推断的路径（0→2→3→4），为每个相邻的细胞簇对分别训练了二元决策树模型，从而识别出驱动每一步转变的关键基因规则：
- •
从干细胞到上皮细胞的转变（0→2）：主要由FABP5的升高来驱动。当FABP5表达>1.203时，细胞倾向于被分类为上皮细胞（Cluster 2）。其他相关基因包括PI3、PERP、CRYAB和SPINK6。
- •
从上皮细胞到间充质干细胞的转变（2→3）：COL1A2是首要的决定性基因。COL1A2表达>0.572是区分间充质细胞（Cluster 3）的关键。同时，KRT16的表达下降也是此转变的特征之一。
- •
在间充质细胞亚型间的转变（3→4）：长链非编码RNA NEAT1的表达降低（≤-0.762）是区分晚期间充质状态（Cluster 4）的主要特征。
这些决策规则以清晰的“if-then”逻辑呈现，例如“如果FABP5 > 1.203且PERP > 0.711且GJA1 ≤ 1.576，则预测为上皮细胞（Cluster 2）”，提供了高度透明和可生物学解读的见解。
关键基因表达模式验证
研究进一步通过特征重要性分析和差异表达检验验证了上述发现。在干细胞向上皮细胞转变中，FABP5、PI3、PERP、CRYAB和SPINK6在上皮细胞中显著上调。在上皮向间充质转变中，COL1A2、COL6A3、SPON2和DCN在间充质细胞中上调，而KRT16下调。在间充质细胞亚型间，NEAT1、COL6A3、FN1和STC2在更晚期的Cluster 4中下调，而YBX1上调。
多样本验证与通用性分析
为了验证分析流程的通用性，研究将该框架应用于一个来自文献的独立ER阳性乳腺癌scRNA-seq数据集（GSE248288）。经过同样的分析步骤，包括批次校正、细胞类型注释和轨迹推断，在该数据集中也成功识别出了上皮细胞向间充质细胞转变的轨迹。训练的决策树模型再次捕获了已知的EMT关键基因，如VIM、FN1和KRT18，同时也发现了如RASGRP2、ADTRP和AZGP1等潜在的区分性基因。交叉数据集评估表明，在一个数据集上训练的模型能够较好地分类另一个数据集中的细胞，证明了该方法的稳健性和跨数据集的通用性。
结论与展望
本研究展示了一种将高分辨率单细胞转录组学、伪时间轨迹推断与可解释机器学习相结合的强大分析框架。该框架不仅精细描绘了乳腺癌肿瘤微环境的细胞组成，更重要的是，以透明、基于规则的方式揭示了驱动细胞状态动态转变（特别是EMT）的关键基因及其精确的表达阈值。所识别出的基因，如FABP5、COL1A2、COL6A3和NEAT1，是潜在的预后生物标志物和新型治疗靶点。尽管本研究受限于单样本分析，但通过独立数据集的验证证明了其方法的普适性。这项工作为在精准肿瘤学背景下，理解肿瘤进化机制和开发个体化治疗策略提供了新的工具和见解。
