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这篇前瞻性研究强调了早期、全面基因检测在肝豆状核变性（WD）诊断中的核心价值。研究开发并验证了一个涵盖全长ATP7B及其他铜代谢相关基因的靶向二代测序（NGS）面板，结果显示其可检测复杂变异（如内含子、拷贝数变异CNV），并能鉴别临床表型相似的疾病（phenocopies），显著提高了不典型病例的诊断率，有助于避免误诊、实现个体化干预。
引言
肝豆状核变性（Wilson disease, WD）是一种由ATP7B基因突变引起的常染色体隐性铜代谢紊乱疾病，可导致铜在肝脏、大脑等多个器官的毒性积聚。作为一种可治疗的遗传病，早期、准确的诊断至关重要。然而，传统的诊断方法主要依赖临床特征、生化检查（如铜蓝蛋白、尿铜）以及莱比锡评分（Leipzig score），在识别不典型或早期病例方面存在局限。常规的基因检测（Sanger测序结合MLPA）存在通量低、难以检测非编码区变异等不足。本研究旨在评估一个靶向全长ATP7B及10个其他铜代谢相关基因的多基因NGS检测面板，在一个大型临床前瞻性队列中的诊断效用。
方法
研究纳入了2016年6月至2019年12月期间，在福建医科大学附属第一医院神经遗传病中心就诊的144名临床怀疑WD的患者。患者入组标准包括无法解释的肝脏疾病或运动障碍，并伴有铜代谢异常。研究对患者的人口学和临床数据进行了收集，并根据莱比锡评分（≥4分为典型WD，<4分为不典型WD）进行分组。遗传学检测方面，研究人员通过靶向NGS对包括ATP7B在内的11个铜代谢相关基因的全长进行测序，平均深度>400X。对识别出的变异进行生物信息学分析和数据库比对，并根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南进行分类。对潜在的致病性变异，通过Sanger测序、多重连接探针扩增（MLPA）和反转录PCR（RT-PCR）进行验证。对于通过NGS未发现致病性ATP7B变异的患者，进一步进行了全外显子组或全基因组测序（WGS）分析。
结果
临床特征与诊断效能
在所有144名入组患者中，基因检测确诊了129名（90%）为WD患者，包括80名典型病例和49名不典型病例。莱比锡评分与基因确诊率并非完全一致。例如，在评分为1分的患者中，仅有62%最终被基因确诊为WD；令人关注的是，在评分为4分的1名患者，虽临床诊断为WD多年，但基因检测未发现双等位基因致病性ATP7B变异，最终被重新诊断为脊髓小脑性共济失调12型（SCA12）。
非WD患者中发现的铜相关基因变异
在15名未携带双等位基因ATP7B致病性变异的患者中，有10人（67%）被检出携带铜代谢相关基因的变异。这包括5名携带杂合CP基因变异的患者，4名携带杂合ATP7B变异的个体，以及1名携带致病性ATP7A基因变异的男性半合子。其中，一名临床诊断为WD、莱比锡评分为4分但病情仍持续进展的患者（N1），NGS仅发现CP基因杂合变异，后续WGS发现了PPP2R2B基因的CAG重复扩增，最终确诊为SCA12，表明其铜代谢异常可能与CP基因变异相关，而神经系统症状则源于遗传性共济失调。这些发现突显了多基因面板在鉴别WD与表型相似的疾病（phenocopies）中的价值。
新型ATP7B变异的致病性解析
本研究共鉴定出10个新型ATP7B变异，包括2个小的插入变异、4个错义变异、1个深内含子变异、1个非典型剪接位点变异以及2个拷贝数变异（CNV）。根据ACMG标准，其中9个被归类为致病性或可能致病性，1个为意义未明变异（VUS）。通过RT-PCR和Sanger测序，研究在体内（利用患者外周血淋巴细胞来源的RNA）证实了深内含子变异c.2866-1259T>A导致了一个130bp的“假外显子”插入，以及非典型剪接位点变异c.3413-21A>G导致了外显子16的完全跳过，从功能层面证实了这些变异的致病性。
讨论
本研究证实，涵盖ATP7B基因全长及其他铜代谢相关基因的靶向NGS面板，能够高效地诊断WD，包括检测传统方法难以发现的复杂变异（如深内含子变异、非典型剪接位点变异、拷贝数变异CNV）。在90%的临床疑似患者中实现了基因确诊，其中38%的患者莱比锡评分低于4分，凸显了传统临床评分的局限性以及早期基因检测的必要性。此外，该面板还能有效识别出由非ATP7B基因（如CP、ATP7A）变异导致的WD“模仿者”，从而避免误诊和不必要的治疗。研究也发现，携带杂合ATP7B变异的个体可能出现轻微临床症状或生化指标异常，其临床意义有待进一步纵向研究。研究支持更新WD的诊断流程，将全面的靶向基因检测（如NGS面板）作为一线诊断策略，特别是对于不典型或早期的疑似病例，这有助于实现精准诊断和及时干预，改善患者预后。尽管本研究是单中心研究，可能存在一定的局限性，但它为临床实践中应用NGS进行WD的全面遗传评估提供了有力证据。
