《Transboundary and Emerging Diseases》：Subtle Genetic Shifts of African Swine Fever Virus Among Vietnamese Domestic Swine Following Live-Attenuated Vaccine Commercialization
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自2019年首次传入以来，非洲猪瘟(ASF)始终威胁着越南养猪业。本研究首次在减毒活疫苗(LAV)商业化应用后，对越南中南部非免疫猪场中非洲猪瘟病毒(ASFV)的核心基因进行了分子流行病学监测。研究发现，疫苗相关毒株在田间发生溢出并持续传播，并揭示了疫苗应用后，包含类疫苗株和新型野毒株在内的遗传多样性显著增加。尤其值得注意的是，在编码p54蛋白的E183L基因中发现了一段独特的15核苷酸串联重复序列，这可能成为越南流行毒株的关键分子标记。这些细微而关键的遗传变化，暗示ASFV在广泛的免疫选择和/或复产期间多样化的病毒引入源所施加的选择压力下，正于宿主体内快速演化，这可能使其能够逃避宿主免疫系统。本研究强调了实施严格的生物安全措施、加强疫苗使用的监管以及开展持续病毒遗传监测的紧迫性，并指出亟需开发可靠的区分感染与免疫动物(DIVA)工具、实时且可定制的分子鉴别方法以及疫苗接种追踪系统，以实现对ASF的持续精准防控。
1. 引言
猪肉是亚洲饮食中重要的蛋白质来源，而新发与再现的传染病严重影响着全球养猪业。非洲猪瘟病毒(ASFV)是导致非洲猪瘟(ASF)的唯一病原体，它是一种具有复杂结构的包膜大型双链DNA病毒。其基因组超过194千碱基对，分为中央保守区(CCR)和两侧的左、右可变区(LVR, RVR)，后者包含具有高突变率的多基因家族(MGF)，是ASFV显著遗传多样性的关键贡献者。传统上，基于编码p72结构蛋白的B646L基因C端一个478-bp片段的分析，将ASFV分为24个基因型(I-XXIV)。而使用多个标记基因(如E183L、EP402R、B602L、I73R/I329L)进行联合分析，可为ASFV的分子流行病学研究提供更好的分辨率。编码CD2v样蛋白(负责病毒红细胞吸附)的EP402R基因也用于将ASFV分为8个血清型(1–8)。与EP402R相邻的EP153R基因编码类似C型凝集素蛋白，与病毒持续感染有关。B602L基因的中央可变区包含四聚体氨基酸串联重复序列，可用于亚基因分型。由E183L基因编码的p54结构跨膜蛋白在病毒粒子的运动和宿主互作中发挥作用，可作为p72基因型内p54亚系的补充标记。此外，分析基因间区(IGR)或编码基因中的串联重复序列是追踪病毒来源和识别传入新地区途径的有效方法。
自2019年疫情暴发以来，越南的ASF已从严重流行转变为地方性流行状态。2020年，越南政府发布了国家防控计划，强调农场和区域生物安全措施以及清群-复养策略。2022年7月，两种基于Georgia 2007/1株骨架的减毒活疫苗(LAV)——NAVET-ASFVAC(缺失I177L基因)和AVAC-ASF-LIVE(缺失六个MGF360/505基因)被引入田间用于预防。尽管采取了疾病控制策略，2022-2023年间ASF的流行中心仍转向了中南部地区。鉴于缺乏关于LAV引入后越南中南部地区ASF情况的信息，本研究旨在评估疫苗相关毒株在非免疫动物中潜在传播的可能性，并使用多标记基因方法研究ASFV的分子流行病学和遗传多样性。这是首次在越南LAV商业化应用后，对中南部地区多个田间样本的ASFV核心基因进行特征分析。
2. 材料与方法
2.1. 样本来源与采集
本研究共纳入298份在LAV引入前后收集的猪样本。其中，疫苗引入前的样本(10份)采集于2019-2020年，由胡志明市Nong Lam大学提供。疫苗引入后的样本(288份)采集于2022年末至2023年，来自越南中南部11个省份的、有ASF感染史但无免疫史的猪场。样本的地理分布和数量在文章中进行了展示。此外，在2023年11月获得了两种商业LAV作为对照。
2.2. 样本处理与质量控制
使用病毒DNA提取试剂盒提取样本和疫苗中的病毒DNA。通过qPCR靶向检测ASFV的B646L基因，以确认ASFV DNA的存在，并只将Ct值低于35的样本纳入后续分析。
2.3. ASFV基因分型与类疫苗株鉴定
使用常规PCR进行ASFV基因分型和类疫苗株鉴定。基因分型采用标准方案靶向B646L基因的C端478-bp片段。当毒力基因被标记基因替换时，可鉴定为类疫苗株。为此，本研究设计了针对ASFV-G-?I177L(NAVET-ASFVAC骨架)疫苗病毒独特插入/缺失区的新引物对，并通过凝胶电泳和测序验证了其特异性。
2.4. 使用分子标记分析ASFV遗传多样性
为评估ASFV遗传多样性，本研究对64份代表性样本(包括58份野毒株和6份类疫苗株)以及两种商业LAV，分析了五个病毒基因组区域：(1)全长E183L基因；(2)位于I73R和I329L基因之间的IGR区中的10-bp串联重复序列；(3)全长EP153R基因；(4)全长EP402R基因；(5)B602L基因中央可变区中的四聚体氨基酸串联重复序列。使用常规PCR扩增目标DNA，引物详情在文中的表格列出。
2.5. 测序与系统发育树分析
对扩增产物进行测序。通过生物信息学工具处理原始测序数据，将序列比对到ASFV参考基因组。在五个靶向基因组区域内分析单核苷酸多态性(SNP)。构建了针对B646L、EP402R和E183L基因的最大似然系统发育树，以深入了解ASFV毒株之间的遗传关系。
2.6. 新型p54蛋白的B淋巴细胞表位和蛋白质结构预测
从获得的E183L基因核苷酸序列翻译出新型p54蛋白的氨基酸序列。使用免疫表位数据库中的B细胞表位预测工具，预测线性B细胞抗原倾向性区域和不连续B细胞表位。利用多种计算机工具分析新型p54蛋白的亲水性氨基酸残基、结构域、二级结构和三维结构，并与野生型ASFV Georgia 2007株的p54蛋白进行比较验证。
2.7. 作图与数据分析
利用在线地图服务生成不同靶向基因对应ASFV变异的地理分布图。使用统计软件进行描述性统计分析。
3. 结果
3.1. ASFV阳性样本验证
在298份DNA样本中，qPCR重新检测确认了257份为ASFV DNA阳性。阳性样本的Ct值在14.9到38.0之间，中位数为26.3。质量控制后有245份样本的Ct值低于35，用于后续分析。
3.2. 基于B646L基因系统发育分析的ASFV基因分型
基于B646L基因C端区域的系统发育分析，所有245份样本和两种LAV均被归类为基因II型ASFV。在包含24个ASFV基因型代表序列的系统发育树中，这些分析样本与基因II型Georgia 2007/1分离株以及来自中国和其他东南亚的分离株聚集在一起，具有100%的核苷酸同一性。本研究未通过B646L基因分析检测到基因I型或新兴的重组基因I/II型。
3.3. 类疫苗株鉴定
在245份样本中，有6份(2.4%)被鉴定为来自非ASF免疫猪场的类疫苗株，分布在11个省份中的3个。本研究新设计的用于检测ASFV-G-?I177L相关毒株的引物对，经cPCR和测序验证了其特异性。在筛查的样本中，鉴定出6份类疫苗株，包括4份(1.6%)与ASFV-G-?MGF相关，2份(0.8%)与ASFV-G-?I177L相关。元数据分析显示，其中5份类疫苗株提交于2023年底，来源于养猪密度高的地区。
3.4. ASFV遗传多样性分析
在用于遗传多样性分析的64份样本中，2019年至2020年(LAV引入前)收集的样本遗传多样性较低，而2022年至2023年(LAV引入后)收集的样本中检测到多种变异。此外，商业LAV的遗传特征与疫苗种子株一致。
具体分析结果如下：
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E183L基因分析：在58份野生型毒株中，有6份(10.3%)在E183L基因的第343至358位核苷酸之间，插入了独特的15核苷酸串联重复序列“AGACCAGCAACAAAC”，导致在p54蛋白的第116位氨基酸后插入了五个氨基酸(Arg-Pro-Ala-Thr-Asn)。系统发育树显示，这些携带插入的毒株形成了一个独立于其他IIa亚基因型毒株的分支。这种新型E183L变体最早于2022年12月在Dak Lak省检测到，随后在2023年传播到Binh Duong和Binh Phuoc省。对插入序列的分析表明，这段15核苷酸重复序列是新型越南p54变体的关键分子标记。计算机分析预测，由此产生的新型p54蛋白具有更长的α螺旋结构，这可能会影响病毒的运动以及与宿主细胞的相互作用。
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B602L基因CVR分析：所有分析的样本在B602L基因的CVR中均含有10个“TATR”氨基酸重复序列，属于CVR-1/Tet-10a亚组，与Georgia 2007/1参考株相同。未发现新的重复单元模式。
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EP153R和EP402R基因分析：在EP153R基因中，在3份样本(两份野毒株，一份类疫苗株)中发现了第52位核苷酸A的缺失。在EP402R基因中，所有样本均被鉴定为血清型8。然而，在野毒株和一份类疫苗株中，在EP402R基因中发现了多处非同义SNP和大片段缺失(如第14位T缺失、第28-29位CT替换、第343位C缺失、第361-477位缺失、第470-480位缺失、第1009-1026位缺失等)。这些突变位于编码CD2v样蛋白的基因区域，可能影响病毒的毒力。携带这些突变的毒株在地理上分布广泛。
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IGR I73R/I329L分析：根据10-bp串联重复序列“GGAATATATA”的数量，将ASFV毒株分为IGR-I、IGR-II和IGR-III三种变异型。在2019-2020年的早期样本中，只检测到IGR-II型。在2022-2023年的样本中，同时检测到IGR-I、IGR-II和IGR-III型，其中IGR-I和IGR-III型只出现在2022年之后。IGR-I型主要与类疫苗株相关，但也出现在一些野毒株中。IGR-III型仅在2023年的三份野毒株中发现，分布于Binh Phuoc和Dak Lak省。
4. 结论
本研究证实，在越南LAV商业化应用后，ASFV基因II型毒株在未免疫猪群中持续流行，并检测到少量类疫苗株的溢出传播。更重要的是，研究发现LAV引入后，ASFV的遗传多样性显著增加，出现了包括新型E183L变体(携带独特的15核苷酸插入)以及EP153R和EP402R基因中的多种微变异在内的新变异。这些遗传变化，特别是E183L基因中的插入，可能作为越南流行毒株的分子标记。在免疫选择和多种病毒引入源的压力下，ASFV可能正在快速演化，以潜在逃避宿主免疫。这凸显了实施严格生物安全措施、加强疫苗监管和开展持续病毒遗传监测的必要性，并亟需开发可靠的DIVA工具、实时分子鉴别方法和疫苗接种追踪系统，以实现对ASF的精准和持续控制。
