基于分子印迹标签的小分子识别

《Journal of Colloid and Interface Science》：Small molecule recognition based on molecularly imprinted labels

分子印迹技术通过构建特异性识别位点实现小分子精准检测，本研究创新性地采用一端定向固定与分子印迹结合的策略，成功制备具有高选择性和灵敏度的纳米球探针。以L-精氨酸为模型 analyte，通过多氢键锚定与模板诱导的分子印迹技术，构建了电化学传感平台，检测限达12.02 pM（S/N=3），线性范围1 nM-1 mM。该策略有效解决了小分子识别单位难获取的瓶颈问题，为生物医学检测提供新范式。

　　

赵轩轩（Zhaoxuanxuan Chen）| 王子伟（Ziwei Wang）| 韩洪亮（Hongliang Han）| 马占芳（Zhanfang Ma）

首都师范大学化学系，中国北京 100048

摘要

在这项研究中，提出了一种创新的分子印迹识别策略，以实现L-精氨酸的特异性识别和标记。该策略为生物医学领域中小分子识别和标记所面临的挑战提供了可行且有效的解决方案。目前，通常使用适配体（aptamers）等特异性识别单元来识别和标记小分子。然而，获取这些识别单元极其困难。为了解决这个问题，我们报道了一种简单且多功能的方法来合成用于小分子识别和标记的纳米球探针。根据分子的结构，使用一端结构作为模板，并结合分子印迹技术（MIT）来构建分子印迹标签（MIL）。这项技术的核心在于MIL对小分子的部分识别，从而构建基于MIL的小分子传感器。作为概念验证，选择L-精氨酸（L-Arg）作为模型分析物来构建电化学传感器，并将L-Arg的一端在电极基底上进行结构定向和固定，成功制备出具有特异性识别功能的MIL探针，用于识别和标记L-Arg的另一端结构。该传感器的检测限（LOD）为12.02 pM（信噪比=3），线性范围为1 nM至1 mM。这种识别策略对于物质标记具有潜力，并为与分子研究相关的领域提供了一个通用概念。

引言

小分子在生物学中具有重要意义，它们不仅参与生命活动的多个关键方面，还在疾病治疗和药物开发中发挥着重要作用。除了其代谢物是细胞内代谢网络的重要组成部分外[1]，小分子还参与细胞信号传导和细胞调控，通过引起分子间的接近相互作用来调节生物过程[2]。由于小分子在细胞信号传导、代谢调控、疾病治疗和药物开发等方面都至关重要[3]，[4]，因此对其识别已经得到了广泛讨论。

分子识别技术的发展对许多研究领域产生了重大影响，包括生物科学[5]、[6]、疾病诊断[7]、[8]和靶向治疗[9]。目前迫切需要将有前景的技术组件（如酶联DNA置换、分子钟摆等）[10]、[11]、[12]、[13]结合起来，利用它们进行分子识别，以开发更显著的方法[14]。由于大分子（蛋白质、核酸等）通常具有复杂的三维结构[15]，这为适配体或抗体识别大分子提供了多个结合位点，从而提高了它们的选择性[16]。因此，筛选出对大分子具有高亲和力的识别单元（抗体或适配体）相对容易。相比之下，小分子通常只有一个低分子量的抗原决定簇，并且不具备免疫原性。这些因素使得针对小分子化合物制备抗体特别具有挑战性[17]。此外，由于小分子适配体的范围极其有限[18]、[19]、[20]，筛选工作也非常困难。因此，创建通用的小分子识别和标记方法已成为最紧迫的问题之一。

如今，色谱法[21]、色谱-质谱法[22]、[23]、光谱法[24]、[25]、[26]、荧光分析[27]、[28]、[29]等方法常用于小分子检测。这些方法在实际应用中得到了广泛应用，但需要复杂的设备并且操作程序相对复杂。在一定程度上，这影响了快速检测的应用。电化学传感器由于操作简便、样品需求少、易于微型化和成本低廉[30]、[31]、[32]、[33]、[34]，在小分子检测方面具有广阔的应用前景。由于小分子主要通过自身的电化学信号进行检测，它们较大的氧化还原电位可能会导致低电位物质在检测过程中发生反应，从而限制了灵敏度和选择性[35]、[36]。为了提高小分子电化学检测的灵敏度和选择性，研究人员经常选择特定的识别单元来解决这些问题[37]。

目前，由于难以获得小分子抗体或适配体，分子印迹技术（MIT）得到了广泛应用。MIT是一种利用目标分析物作为模板，并通过聚合物创建人工识别位点的技术，这些聚合物可以与模板互补，从而特异性地识别目标分析物[38]、[39]。通常，分子印迹聚合物（MIP）整体识别目标小分子[40]、[41]。然而，这种方法受到目标小分子结构类似物的影响，仍然存在选择性较差的问题[42]、[43]。虽然使用与模板相互作用更强的单体[44]或引入强识别单元（如适配体[45]可以在一定程度上解决这个问题，但仍存在问题。使用与模板相互作用更强的单体会使它们更难以洗脱，而且获取针对小分子的强识别单元也非常困难。

为了解决上述问题，本研究提出了一种创新的MIT识别策略。具体来说，基于小分子的部分结构特征（官能团、空间构型等），可以合理设计并制备富含信号物质的分子印迹标签（MIL），以实现特异性标记目标分子。与传统MIT相比，MIL策略有效避免了小分子识别中常见的选择性和灵敏度问题，显著提高了灵敏度和选择性。为了验证MIL识别策略的可行性，本研究使用L-精氨酸（L-Arg）作为主要目标分子构建了电化学传感界面，如图1所示。通过1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将氨基酰胺化的多壁碳纳米管（MWCNTs）连接到2-(4-乙酰胺基苯氧基)乙酸（AAPAC）上，通过多个氢键捕获L-Arg[46]、[47]、[48]。然后，使用甲基丙烯酸（MAA）作为聚合单体，金属离子Cd²⁺作为交联剂和信号物质[49]，以及L-Arg一端的丙氨酸（L-Ala）作为模板，合成MIL。采用反向微乳法制备纳米球。随后使用洗脱液去除模板，留下选择性识别的空腔。通过电化学技术验证了探针的选择性识别能力，并利用MIL校准L-Arg，以识别L-Arg中的丙氨酸结构，从而建立识别模式。

材料与试剂

材料和试剂的详细信息见补充材料。

仪器

仪器的详细信息见补充材料。

MIL的合成

乳液A：混合1.89 mL的Triton X-100、1.23 mL的己醇和4.27 mL的正辛烷，然后加入1 mL的MAA作为功能单体和262.6 mg的L-Ala作为模板，在室温下剧烈搅拌超过10分钟，得到稳定的乳液。乳液B：混合1.89 mL的Triton X-100、1.23 mL的己醇和4.27 mL的正辛烷

材料表征

为了实现小分子部分结构的识别，控制MIL的粒径是前提条件，这通过优化反应物和条件来实现（图S1，表S1-S2）。在后续实验中，合成了L-Ala的MIL（MIL-Ala）、洗脱前的MIL-Ala（MIL(Ala）和非印迹标签（NIL）。MIL-Ala的主要粒径为40 nm（图1），MIL(Ala)和NIL的粒径分别为约90 nm和13 nm（图S2）。洗脱前后的粒径变化较为明显

结论

总之，本研究提出了一种基于分子印迹标签的小分子识别和检测的新方法，有效解决了当前获取小分子识别单元的难题。通过使用L-Arg作为代表性模型分析物，构建了电化学传感模型。与现有方法相比，基于MIL的小分子传感模型的检测限降低了三个数量级。

CRediT作者贡献声明

赵轩轩（Zhaoxuanxuan Chen）：撰写——原始草案、方法学、实验研究、数据分析、数据管理。 王子伟（Ziwei Wang）：验证、方法学、实验研究、数据分析、概念化。 韩洪亮（Hongliang Han）：资源获取、项目管理、方法学。 马占芳（Zhanfang Ma）：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、资金筹集、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（编号22172104）的资助。