铁（氧化氢氧化物）对水平基因转移的浓度依赖性调控：针对质粒和受体细菌的分子机制

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Concentration-dependent modulation of horizontal gene transfer by iron (oxyhydr)oxides: Molecular mechanisms targeting plasmids and recipient bacteria

铁(羟基)氧化物浓度依赖性影响抗生素耐药基因水平转移机制研究，低浓度促进质粒超螺旋结构紧缩及载体介导的DNA摄取，高浓度破坏质粒完整性并激活抗氧化响应。

　　

郑洪光|金乃夫|张丹|杨青|李寿福|王浩源|于梦|徐努超|丁爱忠

北京师范大学水科学学院，中国北京100875

摘要

铁（氧氢）氧化物是土壤和地下水中最常见的活性成分之一。它们在抗生素修复过程中得到广泛应用，参与环境过程，并影响抗生素抗性基因（ARGs）的传播，但它们调节质粒和受体介导的水平基因转移的机制尚不清楚。我们以针铁矿、赤铁矿和水铁矿作为典型的铁（氧氢）氧化物进行了转化实验，旨在阐明它们对水平基因转移的影响及其潜在机制。结果表明，铁（氧氢）氧化物具有浓度依赖性效应：在低浓度（2.5–5 mg/L）下，转化显著增强，5 mg/L时转化子产量增加了1.63至2.90倍；在高浓度（250–1000 mg/L）下，转化显著受到抑制，1000 mg/L时转化子产量减少了0.08至0.22倍。此外，低浓度的铁（氧氢）氧化物使质粒的超螺旋结构更加紧密，从而提高了ARG的吸收效率；而高浓度则破坏了质粒的超螺旋结构和完整性。在受体细胞中，低浓度的铁（氧氢）氧化物增加了细胞内的活性氧（ROS）水平、膜通透性及相关基因的表达，从而提高了转化频率。尽管高浓度的铁（氧氢）氧化物也显著增加了受体细菌的膜通透性和ROS相关基因的表达，但抗氧化酶和渗透压应激反应基因的上调中和甚至降低了细胞内的ROS水平和膜通透性。本研究揭示了铁（氧氢）氧化物对转化的浓度依赖性效应及其对ARGs和受体的分子调控作用，为理解ARG的传播提供了见解，并指导了其在修复中的应用。

引言

细菌感染是人类死亡的主要原因之一，而耐药菌株的出现可能进一步增加病原菌的临床风险。抗生素耐药性已成为一个重大的全球公共卫生问题，也是经济和社会发展的重大障碍[1]、[2]、[3]。抗生素抗性基因（ARGs）在环境中的传播主要通过两种途径推动抗生素敏感菌株向耐药甚至多重耐药菌株的进化：水平基因转移（HGT）和垂直基因转移（VGT）[4]、[5]、[6]、[7]。其中，HGT被认为是主要驱动力，包括三种主要途径：自然转化、转导和接合，分别通过游离DNA、噬菌体和直接细胞间接触实现ARGs的转移[8]、[9]、[10]、[11]。 土壤和地下水是ARGs的主要环境储存库和传播中心[12]、[13]、[14]、[15]。土壤和地下水中游离ARGs（eARGs）的丰富促进了自然转化的广泛发生[16]、[17]。转化不需要细胞间的物理接触；eARGs可以直接作为供体，这一过程在ARGs的传播中起着关键作用[5]、[18]。已知有82种细菌通过转化获得ARGs，包括重要的病原菌如肺炎链球菌、霍乱弧菌和鲍曼不动杆菌属[19]。因此，阐明土壤和地下水中ARGs转化的调控机制对于理解ARGs的传播和制定风险缓解策略至关重要。 铁（氧氢）氧化物是土壤和地下水中的关键成分，也是最常见的活性矿物之一，在生物地球化学循环中起着重要作用[20]、[21]。此外，铁（氧氢）氧化物被广泛认为是有前景的环境功能材料，并已在环境介质中的抗生素修复中得到广泛应用[22]、[23]。为了评估铁（氧氢）氧化物在自然条件下的影响及其作为修复材料的合理应用，有必要阐明它们调节HGT的潜在机制。研究表明，铁（氧氢）氧化物通过诱导膜上孔隙的形成、改变膜结构和促进细胞内活性氧（ROS）的产生来影响细菌转化，从而影响膜通透性和氧化应激反应[24]、[17]。然而，目前的研究主要集中在铁（氧氢）氧化物暴露后受体细菌的表型变化上，基因表达层面的机制仍有待阐明。此外，研究表明某些金属氧化物和纳米级零价铁可能会改变eARGs的构象和完整性，从而影响其吸收效率和生物利用度[25]、[26]。总体而言，铁（氧氢）氧化物调节质粒介导的转化的机制需要进一步研究。 鉴于铁（氧氢）氧化物在土壤和地下水中的普遍存在及其在修复中的频繁使用，了解它们如何调节质粒介导的转化对于评估自然和工程系统中的ARGs传播风险至关重要。在这里，我们旨在通过共同影响细胞外质粒DNA（eARG载体）和受体细菌的生理学来阐明铁（氧氢）氧化物调节ARG转化的机制基础，从而提供关于铁（氧氢）氧化物何时可能放大或抑制环境ARG传播的见解，并指导其在修复中的应用。根据其环境普遍性和不同的物理化学性质（粒径、ζ电位、比表面积、结晶度），选择了针铁矿（Goe）、赤铁矿（Hem）和水铁矿（Fh）作为代表性的铁（氧氢）氧化物[27]。此外，使用了携带氨苄西林抗性和荧光蛋白表达基因的质粒pUC19-EGFP。大肠杆菌（E. coli）广泛分布于医疗和畜牧业废弃物以及各种环境介质中，这增加了其与细胞外ARGs和颗粒表面接触的可能性[28]、[29]。重要的是，据报道E. coli在某些自然条件下（例如低Ca²⁺水平或淡水系统中的温度变化）可以获得转化能力，使其能够吸收细胞外ARGs，支持其在环境ARG传播中的潜在作用[30]。因此，选择了具有转化能力的E. coli DH5α作为模型菌株。使用圆二色光谱（CD）光谱、凝胶电泳、透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）来研究铁（氧氢）氧化物暴露对质粒构象、完整性和行为的影响。结合表型分析和转录组分析，阐明了铁（氧氢）氧化物调节受体细菌细胞内ROS水平、膜通透性和膜组成的潜在分子机制。

材料制备与表征

材料制备与表征

根据其不同的物理化学性质，选择了三种代表性的铁（氧氢）氧化物——针铁矿、赤铁矿和水铁矿，并使用Fe(NO₃)₃·9 H₂O作为前体通过水热法合成[9]、[27]。详细的合成和表征程序见文本1。铁（氧氢）氧化物通过X射线衍射（XRD）、TEM等技术进行了表征（图S1）。具有转化能力的E. coli细胞购自Biyuntian Biotechnology Co.

铁（氧氢）氧化物对ARGs转化的影响

在没有添加铁（氧氢）氧化物的情况下，pUC19-EGFP质粒的转化效率（TE）范围为6.00×10⁴–6.20×10⁴ CFU/μg，转化频率（TF）范围为10.73×10^?5至10.84×10^?5（图1a, b）。如图1c所示，添加2.5–5 mg/L的铁（氧氢）氧化物后，TE和TF显著增加（p<0.01或p<0.001），然后随着浓度的进一步增加而逐渐降低。在25–50 mg/L时，TE和TF与对照组相当或略高

结论

本研究的结果清楚地表明，铁（氧氢）氧化物对ARG转化的影响具有浓度依赖性：低浓度促进转化子的形成，而高浓度则抑制转化。在质粒水平上，主要机制涉及易被吸收的SC质粒的比例、质粒的完整性和聚集行为，以及铁（氧氢）氧化物作为质粒载体的作用。低浓度的铁（氧氢）氧化物

作者贡献声明

杨青：验证。 李寿福：正式分析。 王浩源：可视化。 于梦：资源提供。 徐努超：撰写 – 审稿与编辑，监督。 丁爱忠：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。 郑洪光：撰写 – 原稿撰写，可视化，方法学，正式分析。 金乃夫：概念构思。 张丹：资源提供。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：42472323）和北京市自然科学基金（资助编号：8232037）的支持。