经过恢复的低地人工沼泽在十年内重新恢复了植物和无脊椎动物的多样性，以及沼泽地特有的物种群

《Journal of Environmental Management》：Restoration of exploited lowland raised bogs recovered plant and invertebrate taxa richness and peatland specialists within a decade

该研究首次报道了固氮细菌Klebsiella variicola C1具备双向电子传递能力，通过SEM、荧光光谱和循环伏安法分析发现阳极和阴极生物膜存在差异，外膜脂蛋白载体蛋白主导阳极电子传递，菌毛蛋白负责阴极电子摄入，细胞质NAD(P)依赖性氧化还原酶对ATP合成至关重要，双向EET显著提升氮固定效率。

　　

彭莉|卢玉彪|刘斌新|李欣怡|于静怡|李长林|罗丹|蔡鲁涵|王建新

浙江海洋大学海洋科学与技术学院，舟山，316022，中国

摘要

产电菌作为阳极催化剂，可催化氮的固定。目前，仅有少数产电菌能够在生物固氮过程中同时进行向外的和向内的细胞外电子转移（EET）代谢途径。氮固定过程中双向EET耦合的机制尚未得到充分阐明。本研究首次报道了一种具有双向EET能力的固氮细菌株Klebsiella variicola C1。通过扫描电子显微镜（SEM）、三维荧光光谱和循环伏安法（CV）研究了阳极和阴极形成的生物膜的差异。利用基于荧光的定量PCR和比较蛋白质组学方法探讨了参与双向EET途径和氮固定的关键基因和蛋白质。结果表明，外膜脂蛋白载体蛋白主要负责将电子从细胞传递到阳极，而菌毛蛋白可能主要负责从阴极吸收电子。此外，位于细胞质中的NAD(P)依赖性氧化还原酶在ATP合成中起关键作用，这可能有助于在阳极实现高效的氮固定。总体而言，这些结果表明K. variicola C1的双向EET对其氮固定性能有显著影响。

引言

生物固氮对于促进可持续农业和环境保护至关重要。目前，氨的工业生产主要依赖于哈伯-博施工艺，该工艺会产生大量二氧化碳（Wang等人，2019年）。因此，开发环保、可持续且可重复使用的氮还原替代方法变得越来越有吸引力（Chen等人，2018年）。

电化学氮还原被认为是一种有前景的、环保且可持续的氮固定方法（Guo等人，2020年）。此外，光电催化技术也被应用于实现可持续氮固定（Zhang等人，2022年）。然而，由于合成过程复杂和电极材料成本高昂，电化学方法面临重大挑战（Islam等人，2023年）。因此，生物固氮（BNF）将N₂还原为NH₃被认为是实现可持续氮利用的关键方法（Zhang等人，2023年）。重要的是，许多固氮微生物（NFM），如Geobacter属物种，可以通过EET途径将碳源氧化产生电能。在外电细菌（exoelectrogens）在微生物电化学系统（MES）的电极表面占主导地位，这有助于高效电子交换（Zakaria等人，2018年）。微生物电解池（MECs）通过使用微生物作为生物催化剂显示出氮固定的潜力（Chen等人，2020年）。Geobacter和Methanocorpusculum可以利用水产生的电子将大气中的氮转化为NH₃（Ortiz-Medina等人，2019年）。然而，MEC技术需要持续的外部能量供应来维持还原反应，这限制了生物电极上的氮酶活性（Cai等人，2018年）。相比之下，MFC提供了一种可行的方法来解决外部能量供应问题，因为它可以利用产电微生物作为阳极催化剂来实现电子转移，并通过氧化底物（污染物）提供能量。因此，它将是氮固定和同时处理废水的一种有前景的技术（Li等人，2022年）。

从理论上讲，N₂还原反应消耗大量电子，尤其是在缺乏碳源的情况下，会与阳极电极竞争电子，从而降低MFC的性能。有趣的是，Jing等人证明G. sulfurreducens的阳极呼吸驱动了氮还原，实现了BNF和电能的同时产生。此外，G. sulfurreducens的氮固定促进了EET途径，生成ATP以支持其自身的代谢（Jing等人，2022年）。对于产电细菌而言，向外的EET过程通常指的是它们利用底物直接或间接将电子传递到阳极的过程。相反，向内的EET过程是指它们在阴极直接或间接接收电子的过程，使用电子介质。然而，大多数研究主要集中在阳极的氮固定过程中的向外EET，而只有少数电活性细菌（EAB）在纯培养中表现出双向EET能力。众所周知，外电细菌在阳极和阴极电子转移过程中执行不同的EET途径（Ye等人，2018年）。例如，Strycharz等人发现G. sulfurreducens中编码单血红素c型细胞色素的基因与向外EET相关，删除后完全消除了向外EET，而向内EET未受影响（Strycharz等人，2011年）。这表明在阴极模式下，替代的细胞外电子介质可能参与向内EET（Heidary等人，2020年）。不幸的是，由于缺乏功能足够的细菌，双向EET过程影响氮固定的机制尚不清楚。在本研究中，我们在实验室分离出了一种具有双向电子转移能力的固氮产电细菌K. variicola C1（Cai等人，2024年）。我们的目标是：（1）通过表征阴极和阳极生物膜的电化学和生物膜特性，区分双向EET过程中的氮固定性能差异；（2）使用实时荧光定量PCR（q-PCR）和生化检测方法定量测量参与双向细胞外电子转移（EET）氮固定过程的一些关键基因和电子介质；（3）通过蛋白质组学分析预测双向EET过程中的氮固定机制。此外，本研究提出了一种通过高效电化学氮固定处理缺氮废水的新策略。

媒体和细菌

所有化学试剂均从中国上海的Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.和Aladdin Industries Corporation购买。氮缺乏培养基（NDM）的组成如下（每升）：7克K₂HPO₄、3克KH₂PO₄、0.1克FeSO₄·7H₂O、0.1克MgSO₄·7H₂O、5克CH₃COONa以及1毫升微量元素溶液，调整至pH 7.0。阳极培养基（AM）的组成如下（每升）：5克CH₃COONa、0.3克(NH₄)₂SO₄、0.7克KNO₃、3克KH₂PO₄、7克K₂HPO₄、0.1克

具有双向电子转移的生物膜的原位分析

使用碘化丙啶（PI）和SYTO 9通过荧光显微镜进行细胞活力评估，采用活/死细胞染色方法（如图1A–D和G所示）。死细胞由PI的红色荧光标记，而SYTO 9发出的绿色荧光同时标记了活细胞和死细胞。荧光染色分析显示，A-MFC组（图1A和图S1）的生物相容性优于其他组（图1C和E）。

结论

总之，K. variicola C1表现出催化双向电子转移的能力，实现了氮₂的固定和生物电力的生成。在细胞膜中，电子传输和ATP生成遵循类似的代谢途径，主要涉及周质中的呼吸链（缺乏复合体III和IV）、外膜蛋白以及周质蛋白。值得注意的是，一种周质蛋白，特别是外膜脂蛋白载体蛋白，可能起着关键作用

CRediT作者贡献声明

彭莉：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。卢玉彪：可视化、概念化。刘斌新：研究、正式分析。李欣怡：正式分析。于静怡：可视化。李长林：研究。罗丹：可视化。蔡鲁涵：研究。王建新：撰写——审稿与编辑、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了浙江省重点研发项目（2023C03120）、浙江省高校和科研机构基础研究基金（编号：2024J006）、舟山市科学技术局（2022C41019）、Jurong石油和天然气大学-企业联合实验室项目“Jie Bang Gua Shuai”（JR2025J008）以及浙江省大学生科技创新活动计划（2025R411B036）的财政支持。