《Journal of Environmental Management》：Genome-resolved metagenomic insights into cornstalks-mediated reduction of pathogens and antibiotic resistomes during passively aerated static composting of swine manure
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本研究通过基因组分辨率元基因组学分析，探究玉米秸秆在被动式静态堆肥中改善抗生素抗性基因（ARGs）消除的效果。结果表明，添加10%玉米秸秆显著提升堆肥温度（>65℃）和氧气渗透性，抑制ARG宿主菌（如放线菌门）及水平基因转移（HGT），使ARG去除率提高49.0%以上。
夏若涵|施彤|刘万岑|李国学|支素丽|罗文海|徐志成
中国农业大学资源与环境科学学院，北京农田土壤污染预防与修复重点实验室，北京，100193，中国
摘要
被动通风静态堆肥技术被广泛用于畜禽粪便的处理；然而，由于氧气扩散效果不佳，该技术在消除抗生素抗性基因（ARGs）和病原体方面的效果往往不够理想，这限制了有机物的生物降解过程，从而阻碍了嗜热条件的形成。尽管关于好氧堆肥的研究已经相当深入，但在猪粪的被动通风静态堆肥过程中，作物秸秆的最佳添加策略及其对ARG动态变化的机制作用仍不明确。本研究以玉米秸秆和猪粪为研究对象，利用基因组解析的宏基因组学和多元统计分析方法，阐明了如何通过添加玉米秸秆来有效促进ARG的消除。结果表明，添加10%的玉米秸秆显著改善了堆肥性质（如水分含量和氧气渗透性），并提高了堆肥温度（超过65°C），从而有效灭活了携带ARG的细菌，并抑制了水平基因转移（HGT）。在这些条件下，玉米秸秆的添加促进了ARG携带菌（如放线菌门）的热失活，尤其是致病性抗生素抗性细菌（如Corynebacterium），进而抑制了HGT。更重要的是，在堆肥过程中，染色体编码的移动遗传元件（而非质粒和病毒）主导了HGT。多重耐药性基因、杆菌肽抗性基因和大环内酯-林可酰胺-链霉素抗性基因的转移主要通过细菌门内的HGT事件实现。玉米秸秆的添加显著加速了病原体和ARG携带菌的失活，使这两种抗性的去除率分别提高了49.0%以上。这些发现为优化被动通风静态堆肥技术、实现畜禽粪便的安全农业再利用提供了机制上的启示。
引言
全球肉类市场的不断扩大推动了畜牧业和家禽业的快速发展，导致畜禽粪便产量大幅增加。据估计，中国每年的粪便产量已达40亿吨（Zhang等人，2025年）。猪粪中含有多种多样的生物污染物，包括抗生素抗性基因（ARGs）和病原体，这些物质在其处理和回收过程中存在潜在的健康风险（Abdellah等人，2023年；He等人，2020年）。对4017份畜禽粪便宏基因组的分析显示，猪粪中的ARGs相对丰度为每细胞3.12个拷贝，明显高于其他类型粪便（如牛粪，每细胞0.89个拷贝）（Li等人，2025年）。作为一种简单、经济且适用于现场处理的工艺，被动通风静态堆肥技术目前在中国畜禽粪便管理和生物肥料生产中占据主导地位。与好氧堆肥不同，被动通风静态堆肥完全依赖空气自然扩散来支持堆内微生物的活动，将畜禽粪便转化为生物肥料，无需额外的能源用于通风和翻动。
由于畜禽粪便的物理结构紧密，被动通风静态堆肥的效果常常受到氧气扩散不足的限制，导致热条件不佳，从而影响生物污染物的有效去除。有研究表明，在被动通风静态堆肥过程中，ARGs及其宿主（尤其是病原体）的数量可能会显著增加（Wang等人，2021年；Zhao等人，2022年）。因此，亟需开发一种低成本且实用的策略来减轻抗生素抗性并提高堆肥的安全性。
尽管被动通风静态堆肥在畜禽粪便处理中应用广泛，但相关调控机制的研究仍十分有限。玉米秸秆常被用作好氧堆肥中的填充剂（Cheng等人，2023年），可以加速有机物的生物降解，进而提高温度，促进抗生素抗性细菌的失活（Liu等人，2021a,b；Wang等人，2024年）。Wang等人（2024年）的研究表明，添加15%（湿重）的玉米秸秆可将猪粪好氧堆肥过程中的嗜热阶段延长58%，从而提高ARG的去除率。虽然玉米秸秆能增强好氧堆肥中的ARG去除效果，但其最佳添加比例以及其在被动通风静态堆肥中通过微生物驱动的水平基因转移和垂直基因转移对抗生素抗性组的调控机制仍不清楚。
抗生素抗性可通过水平基因转移（HGT）和垂直基因转移（VGT）传播，增加健康风险（Godijk等人，2022年）。细菌接合、自然转化和噬菌体介导的转导机制使得HGT能够在细菌属间和属内发生。多项研究利用网络分析和高通量定量PCR技术研究了抗性基因、移动遗传元件（MGEs）和细菌群落之间的共现模式，从而识别出ARGs的潜在宿主和HGT事件。然而，由于分析方法的局限性，这些结果关于潜在宿主和转移事件的准确性仍需进一步验证。此外，不同类型的MGEs（染色体和质粒上的）以及噬菌体转导在被动通风静态堆肥过程中对ARGs水平转移的贡献尚不清楚。宏基因组学的进步有助于通过基于测序数据、组装的contigs和基因组分箱方法的综合分析，揭示ARGs转移的潜在机制。例如，Guan等人（2022年）发现，在城市河床沉积物中，质粒是驱动ARGs水平转移的主要MGEs，Romboutsia timonensis和Methanothrix soehngenii携带多种抗性基因和整合/接合元件（ICEs），能够传播抗生素抗性。但目前尚无研究探讨被动通风静态堆肥过程中ARGs动态变化和潜在HGT事件的机制。
本研究旨在确定在被动通风静态堆肥过程中有效调控ARGs动态的玉米秸秆最佳添加比例，并利用基因组解析的宏基因组学方法阐明其背后的机制。研究了原料的物理化学性质、细菌群落和病原体的演替过程，量化了ARGs和MGEs的丰度和多样性，分析了移动ARGs在染色体、质粒和病毒上的分布情况。通过分箱分析进一步确定了ARGs的细菌和病毒宿主，揭示了细菌组、病毒组和抗生素抗性组之间的相互作用。这些结果为被动通风静态堆肥过程中高效去除抗生素抗性组提供了实用策略，从而促进了畜禽粪便的安全农业再利用。
实验材料
本研究以猪粪和玉米秸秆作为堆肥原料。这些材料分别来自北京的当地养猪场和农田。玉米秸秆经过风干处理后，切成2-4厘米的长度以改善堆肥结构。原材料的基本物理化学特性见表1。
实验方案
堆肥实验于2022年9月至11月在中国北京的上庄实验站进行。
物理化学特性
添加玉米秸秆可以调节堆肥堆的物理化学性质，促进有机物降解，从而加速温度上升（图1A）。添加玉米秸秆的处理过程经历了好氧堆肥中常见的四个阶段：中温阶段、嗜热阶段、冷却阶段和成熟阶段。相比之下，未添加玉米秸秆的处理组（0%CS）由于水分含量高和结构紧密，堆肥温度始终低于35°C。
结论
研究结果表明，向猪粪中添加10%（湿重）的玉米秸秆可通过杀菌作用抑制水平基因转移，有效减少抗生素抗性组的含量。玉米秸秆的添加改善了堆肥的物理化学性质（如水分和氧气含量），使堆肥温度升高，加速了ARG携带菌（尤其是C. coli和E. coli）的热失活。
作者贡献声明
夏若涵：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、概念构建。施彤：撰写初稿、数据可视化、实验设计、数据管理。刘万岑：数据可视化、实验设计、数据管理。李国学：结果验证、实验监督、方法设计、概念构建。支素丽：数据可视化、实验设计、概念构建。罗文海：撰写修订稿、结果验证、实验监督、项目管理、资金协调
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2023YFD1702000）、国家自然科学基金（52470169）和中国农业大学2115人才发展计划的资助。宏基因组测序工作由深圳Wekemo Tech集团有限公司提供支持。
