《Andrology》：T Cell Microenvironmental Impacts and Therapeutic Opportunities: Application to Human Testicular Germ Cell Tumors
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这篇综述深入探讨了睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）独特的免疫微环境，重点解析了肿瘤浸润T细胞（特别是CD4?和CD8?亚群）的表型多样性、功能可塑性及其在抗肿瘤免疫与免疫逃逸中的双重作用。文章强调了TGCT睾丸免疫豁免状态被破坏的特征，并指出尽管免疫检查点抑制剂（ICI）和CAR-T疗法在其他癌症中取得成功，但它们在TGCT中的疗效有限，这主要源于对该肿瘤免疫微环境（TME）中T细胞动力学的认知不足。最后，文章展望了利用单细胞转录组学等高分辨率技术阐明T细胞机制，为开发克服耐药、减少长期后遗症及改善临床预后的新型TGCT免疫疗法提供关键见解。
1. 睾丸生殖细胞肿瘤生物学及肿瘤浸润T细胞的意义
睾丸癌是15-44岁年轻男性中最常见的恶性肿瘤，约占男性新发癌症的1%，其全球发病率在过去几十年显著上升。超过95%的睾丸肿瘤起源于性未分化的原始生殖细胞或最早的精原前体细胞（性原细胞或前精原细胞），这些细胞获得染色体畸变（包括i12p等臂染色体）并导致胎儿睾丸中出现原位生殖细胞瘤变（GCNIS）。青春期后，这些未成熟细胞持续存在可转化为两种亚型的睾丸生殖细胞肿瘤（TGCT）：纯粹的精原细胞瘤（SE）或非精原细胞瘤（NSE）。SE是TGCT的主要形式（约占60%），由均质的性原细胞样细胞构成。NSE则具有异质性，可表现为胚胎性癌、卵黄囊瘤、绒毛膜癌和畸胎瘤。虽然大多数TGCT在根治性睾丸切除术后预后良好，但患者仍面临治疗抵抗、复发、不育以及心血管疾病风险增加等长期影响。
除了隐睾、不育、GCNIS存在、家族史和基因突变等已知风险因素外，免疫细胞浸润已被确定为TGCT的一个标志。睾丸免疫细胞景观的深刻变化及其与生殖细胞和睾丸体细胞（支持细胞、间质细胞等）的相互作用，共同促成了TGCT中独特的肿瘤微环境（TME）。鉴于T细胞是肿瘤浸润免疫细胞（肿瘤浸润淋巴细胞）的主要组成部分，开发基于（重新）激活患者自身T细胞的免疫疗法可能是一个有前景的选择。然而，由于对TGCT TME的理解不足，基于免疫检查点抑制剂的免疫疗法临床试验在TGCT中大多失败。因此，对TGCT亚型及其各自免疫环境进行深入分析，是开发成功的T细胞免疫疗法、减轻TGCT年轻患者负担的先决条件。
1.1 人类睾丸的生理免疫环境
睾丸是一个免疫豁免器官，能够长时间维持异体组织移植而不被排斥。这种特殊免疫调节的生理学重要性源于需要防止针对减数分裂和减数分裂后生殖细胞特异性“非我”抗原的有害免疫反应。所有睾丸体细胞群都通过产生一系列局部介质，共同营造了免疫豁免的免疫抑制环境。
支持细胞形成生精上皮，是精子发生和睾丸免疫调节的关键。它们形成血睾屏障（BTB），将生精上皮分为基底室和近腔室，以保护发育中的生殖细胞。近期研究表明，生殖细胞抗原能够穿越BTB，这凸显了在解剖屏障之外，需要强大的局部免疫调节机制来维持免疫豁免。在睾丸微环境中，支持细胞和间质细胞通过产生半乳糖凝集素-1、胰岛素样生长因子-1、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO1）、TGF-β、激活素-A、SERPINA3N、SERPINB9、IL-6、IL-1β、TNF-α、β-防御素和IFN-γ等免疫调节因子，抑制补体激活、调节免疫细胞增殖并抑制细胞凋亡，从而保护生殖细胞免受感染和自身免疫攻击。
在生理条件下，巨噬细胞是正常睾丸中主要的常驻免疫细胞，大多呈现抗炎的M2表型，通过产生IL-10和TGF-β抑制T细胞活化。肥大细胞也常见于健康睾丸，有助于先天免疫、组织稳态/重塑和适应性免疫。健康睾丸中仅有极少量的树突状细胞（DCs），并且没有B细胞。T细胞约占健康哺乳动物睾丸总免疫细胞的10-20%，包括CD4?辅助性T细胞（Th）和CD8?细胞毒性T细胞（Tc）等亚型。睾丸微环境中局部分泌的免疫调节和免疫抑制介质被认为可减弱T细胞活化并维持免疫耐受，但T细胞在正常睾丸中的具体作用和相互作用动力学尚不清楚。
1.2 睾丸炎症和TGCT中的免疫细胞——概述
在炎症条件下，睾丸中的巨噬细胞可向促炎的M1表型转变。在TGCT中，无论是SE还是NSE，巨噬细胞的数量都有所增加。在SE中，巨噬细胞是仅次于T细胞的第二常见浸润免疫细胞类型；而在胚胎性癌中，检测到的巨噬细胞比T细胞更多。有研究认为巨噬细胞在SE中支持肿瘤生长。
在精子发生障碍、睾丸萎缩和睾丸炎症中观察到肥大细胞数量增加，但其在TGCT中的具体功能了解甚少。有趣的是，有报道称GCNIS和SE中不存在肥大细胞，而其他研究则在特定情况下将肥大细胞描述为支持肿瘤的免疫细胞。
DCs在实验性自身免疫性睾丸炎以及GCNIS和SE/NSE中均显著增加。B细胞在TGCT中经常被检测到，在SE中密度最高，它们可以组织成类似滤泡结构的三级淋巴结构。最近的单细胞RNA-seq分析在SE中识别出不同的幼稚B细胞、记忆B细胞和浆细胞群体。值得注意的是，B细胞已成为SE中第二丰富的浸润免疫细胞，突显了它们在肿瘤免疫微环境中的潜在重要性。
1.3 T细胞在恶性肿瘤中的意义——在TGCT中已知的信息
T细胞是适应性免疫的核心，协调细胞介导的免疫反应，在健康和疾病中都至关重要。T细胞是人类睾丸中研究最多的免疫细胞之一，在睾丸炎症中也是如此。作为本综述的核心关注点，我们将聚焦于TGCT中的T细胞，重点介绍它们在TGCT中的定位、表型和功能特征，以及它们在调节肿瘤微环境、影响TGCT发生、进展和预后中的推定作用。
根据T细胞受体亚基的组成和核心谱系细胞表面标志物的表达，T细胞可大致分为CD4? Th细胞和CD8? Tc细胞，并进一步由其特定的细胞因子谱细分为众多亚群（见表1）。重要的是，T细胞亚群并非终末固定，而是表现出显著的可塑性，使其能够根据局部微环境的信号调整其表型和功能。这种可塑性在TME中尤为明显，复杂的细胞因子、细胞相互作用和代谢信号可以重编程T细胞，驱动其在效应、调节和耗竭表型之间转换，从而深刻影响肿瘤发展、进展、免疫逃逸机制和治疗抵抗。
除可塑性外，T细胞还会发生耗竭，这是一种在持续抗原刺激（如在慢性感染或TME中）下出现的功能障碍状态。耗竭的T细胞表现出效应功能减弱，包括细胞因子分泌减少和PD-1等抑制性受体上调，最终削弱其介导有效抗肿瘤反应的能力。这一现象是肿瘤细胞免疫逃逸的关键机制。值得注意的是，Lu等人最近在SE中发现了CD4?和CD8?耗竭T细胞亚型，这些细胞大多位于肿瘤区域附近，这表明耗竭T细胞亚型可能导致抗肿瘤免疫反应受损并促进肿瘤免疫逃逸。TGCT中耗竭T细胞的发现凸显了免疫检查点通路的相关性，并突出了靶向T细胞耗竭以增强TGCT抗肿瘤免疫力的治疗策略潜力。
迄今为止，对TGCT样本的深入分析已识别并部分表征了与健康睾丸相比数量增加的CD3?总T细胞，以及进一步的CD4? Th、CD8? Tc及其部分亚型。尽管CD4? Th和CD8? Tc亚群已在多种癌症类型中得到广泛表征，但它们在TGCT中的具体作用仍未被充分界定。
1.4 CD4?辅助性T细胞
CD4? Th细胞支持B细胞产生抗体，并刺激CD8? Tc细胞和巨噬细胞功能。在TME中，CD4? Th细胞可以直接靶向并清除肿瘤细胞。CD4? Th细胞进一步分化为Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg和滤泡辅助性T（Tfh）细胞等亚型。
CD4? Th1细胞以产生IFN-γ、IL-2和TNF-α为特征，表达谱系特异性转录因子T-BET。它们通过IFN-γ激活巨噬细胞向抗肿瘤的M1表型极化，并通过分泌IFN-γ直接消除肿瘤细胞。在TGCT中，已在GCNIS和SE中检测到Th1驱动的IL-2和IFN-γ产生。
CD4? Th2细胞产生大量IL-4、IL-5和IL-13，表达转录因子GATA3。在癌症免疫中，Th2细胞发挥双重作用。来自Th2细胞的IL-10抑制抗肿瘤反应，而IL-4通常通过诱导免疫抑制性M2巨噬细胞来促进肿瘤进展。尽管尚未在人类睾丸中明确鉴定CD4? Th2细胞，但在SE中检测到其特征性细胞因子，表明TGCT微环境中存在Th2型免疫反应。
CD4? Th9细胞大量产生多效性细胞因子IL-9，其分化主要由TGF-β与IL-4共同调节。它们的抗肿瘤作用主要归因于IL-9的分泌，这在黑色素瘤、肺腺癌和结肠癌等多种恶性肿瘤中已得到证实。
CD4? Th17细胞产生大量IL-17及少量IL-22、IL-21和GM-CSF，表达转录因子RORγt。迄今为止，CD4? Th17在人类睾丸中的功能尚不清楚。它们存在于实验性自身免疫性睾丸炎的大鼠睾丸中，并被认为与慢性炎症的发生和维持有关。在癌症中，CD4? Th17在癌症免疫中可发挥双重作用，既能通过血管生成和免疫抑制活性促进肿瘤进展，也能通过募集各种免疫细胞到TME、刺激CD8? Tc细胞、影响CD4? Th1细胞的表型以及改变IFN-γ的产生来刺激抗肿瘤免疫反应。
CD4? Th22细胞产生大量IL-22，而IL-17和IFN-γ水平较低或缺失。它们在自身免疫性疾病、炎症以及包括肝细胞癌、结肠癌、乳腺癌和肺癌在内的各种癌症中发挥核心作用。在睾丸中，检测到的IL-22被假设主要来自CD4? Th17。
CD4? Treg细胞的特征是高表达谱系特异性转录因子FOXP3。IL-2和TGF-β是其分化的核心。Tregs可通过高表达IL-10、TGF-β、IL-35、CTLA4（CD152）、CD39（ENTPD1）和CD73（NT5E）直接或间接靶向其他T细胞（如CD4? Th和CD8? Tc）或调节抗原呈递细胞。Tregs是人类睾丸中研究最多的CD4? Th细胞之一，已知可调节生理免疫环境。重要的是，Tregs已在人类TGCT中被识别，主要集中在SE的肿瘤中心。这种空间富集表明它们在调节免疫抑制性TME、协调局部抗肿瘤免疫反应和促进免疫逃逸机制中起作用。
CD4?滤泡辅助性T（Tfh）细胞在次级和三级淋巴器官的淋巴滤泡生发中心分化，在抗体和记忆B细胞产生中起关键作用。CD4? Tfh细胞以表达CXCR5和特异性转录因子BCL6以及产生IL-21、IL-4和IL-6为特征。尽管大多数研究将CD4? Tfh与各种癌症患者的长期生存联系起来，但也有研究认为CD4? Tfh细胞对长期生存有不利影响。关于CD4? Tfh在人类睾丸和TGCT中的知识非常有限，但最近已在含有三级淋巴结构的SE中被识别，它们靠近B细胞、CD4? T细胞和DCs。CD4? Tfh（或增加的CXCL13和CCL-5转录本）的最高密度在SE的肿瘤中心附近检测到（CD4? Treg也是如此），在NSE和GCNIS中数量较少。最近对SE样本的单细胞分析识别出四个CD4? T细胞亚群（CCR7?幼稚Tn、GZMA?效应记忆Tem、CXCL13?耗竭Tex和FOXP3? Treg），具有独特的特征基因。表达耗竭特征的CD4? T细胞更靠近肿瘤细胞，而幼稚和效应记忆细胞主要位于远离肿瘤细胞的地方。
1.5 CD8?细胞毒性T细胞
CD8? Tc细胞是适应性免疫的关键效应细胞，通过释放穿孔素、颗粒酶和细胞因子（如IFN-γ和TNF-α）直接识别并杀死肿瘤细胞或感染细胞。与CD4? Th细胞类似，CD8? Tc细胞也可以分化为具有不同功能特征的亚群，包括Tc1、Tc2、Tc9、Tc17和Tc22。这些亚群的平衡显著影响抗肿瘤免疫反应的结果。
CD8? Tc1细胞产生IFN-γ和TNF-α，并表达高水平的颗粒酶B和穿孔素，是抗肿瘤免疫的主力。它们由IL-12和IFN-γ诱导，并表达转录因子T-bet。在TGCT中，Tc1细胞被认为在控制肿瘤生长中起重要作用，有研究显示TGCT中CD8? T细胞浸润与更好的预后相关。然而，肿瘤微环境中的免疫抑制因素可能导致其功能受损或耗竭。
CD8? Tc2细胞产生IL-4、IL-5和IL-13等2型细胞因子，表达转录因子GATA3。与Th2细胞类似，Tc2细胞在肿瘤免疫中的作用存在争议，可能通过诱导M2巨噬细胞极化而促进肿瘤进展，也可能在某些情况下通过招募嗜酸性粒细胞发挥抗肿瘤作用。在TGCT中，Tc2细胞的存在和功能尚不清楚。
CD8? Tc9细胞是产生IL-9的细胞毒性T细胞亚群，其分化依赖于TGF-β和IL-4。在癌症中，Tc9细胞表现出强大的抗肿瘤活性，其作用机制可能与招募和激活其他免疫细胞（如树突状细胞和自然杀伤细胞）以及增强T细胞记忆有关。尽管在黑色素瘤和肺癌等癌症中显示出治疗潜力，但Tc9细胞在TGCT中的作用仍有待探索。
CD8? Tc17细胞产生IL-17A和IL-17F，表达转录因子RORγt。与Th17细胞类似，Tc17细胞在肿瘤免疫中扮演“双刃剑”角色，既能通过促进炎症和血管生成加速肿瘤进展，也能通过招募中性粒细胞等髓系细胞间接增强抗肿瘤免疫。关于Tc17细胞在TGCT中的研究非常有限。
CD8? Tc22细胞以产生IL-22为特征，表达芳香烃受体（AhR）和STAT3。IL-22通常与组织修复和屏障功能维护相关，但在肿瘤环境中可能通过激活STAT3通路促进肿瘤细胞增殖、生存和转移。Tc22细胞在TGCT中的存在和功能尚属未知。
在TGCT的TME中，CD8? Tc细胞的功能状态受到严格调控。耗竭的CD8? T细胞高表达PD-1、TIM-3、LAG-3等抑制性受体，效应功能严重受损。最近的研究在SE中鉴定出耗竭的CD8? T细胞亚群，它们位于肿瘤附近，提示肿瘤诱导的T细胞功能障碍是TGCT免疫逃逸的重要机制。逆转T细胞耗竭，例如通过使用抗PD-1/PD-L1抗体，是TGCT免疫治疗的一个重要研究方向。
1.6 总结与展望
TGCT的肿瘤微环境是一个复杂且动态的生态系统，其中T细胞，包括多种CD4?和CD8?亚型，扮演着核心角色。生理状态下睾丸的免疫豁免特性在TGCT中被破坏，导致免疫细胞（尤其是T细胞）的浸润和功能的显著改变。这些T细胞表现出显著的表型多样性和功能可塑性，并在抗肿瘤免疫和促肿瘤进展之间保持着微妙的平衡。Treg和耗竭T细胞的增多，以及特定效应T细胞功能的抑制，共同营造了一个免疫抑制性的微环境，促进了TGCT的进展和免疫逃逸。
尽管以PD-1/PD-L1和CTLA-4为靶点的免疫检查点抑制剂在多种癌症中取得了革命性成功，但在TGCT中的临床试验结果却不尽如人意，这突显了我们对TGCT独特免疫微环境认知的不足。开发有效的TGCT免疫疗法需要更深入地理解其TME中不同T细胞亚群的组成、空间分布、相互作用网络及其功能状态。
新兴的技术，特别是单细胞转录组学、空间转录组学和多重免疫荧光，为高分辨率解析TGCT的免疫图谱提供了强大工具。这些技术能够精确鉴定T细胞亚群，揭示它们的异质性和可塑性，绘制细胞间相互作用网络，并识别新的治疗靶点。未来的研究应致力于整合多组学数据和临床信息，以建立TGCT免疫分型体系，预测免疫治疗反应，并指导个体化治疗策略的开发。
此外，除了免疫检查点抑制剂，其他免疫治疗策略也值得探索，例如：联合疗法（免疫检查点抑制剂与化疗、靶向治疗或疫苗联合）、过继性细胞疗法（如工程化T细胞受体T细胞或CAR-T细胞）、靶向其他免疫抑制细胞（如Treg或肿瘤相关巨噬细胞）以及调节细胞代谢等。鉴于TGCT患者主要是年轻男性，治疗策略还需特别考虑对生育能力和长期生活质量的保护。
总之，全面阐明TGCT TME中T细胞的生物学行为，是克服当前免疫治疗瓶颈、开发新一代高效低毒疗法的关键。这需要基础和临床研究者的紧密合作，最终目标是改善TGCT患者的临床
