基于两种新型羧基化氮杂环-铜配位漆酶类似纳米酶的比色传感器阵列的构建，用于识别酚类内分泌干扰物

《Journal of Hazardous Materials》：Construction of a colorimetric sensor array based on two novel carboxylated nitrogen heterocycle-copper coordinated laccase-like nanozymes for identifying phenolic endocrine disruptors

本研究通过设计含氮杂环配体调控铜纳米酶的催化性能，合成了CuINA和Cu2Cl-4PDA两种新型纳米酶，其催化活性较CuNA提升3倍（CuINA）和2倍（Cu2Cl-4PDA）。构建的四通道比色传感器结合机器学习，可在10-100 μM浓度范围内实现五种结构相似酚类内分泌干扰物（BPA、BPF、BPS、DES及邻苯二酚）的定性鉴别与半定量检测，并展现出pH 4-11、30-90℃、高盐及长期存储下的优异稳定性。该技术为复杂水体中PEDs的快速筛查提供了新策略。

　　

李凯|王学松|陈希星池|韩青|黄辉|李永新

地下水资源与环境重点实验室（吉林大学），教育部，吉林大学新能源与环境学院，长春130021，中国

摘要

酚类内分泌干扰物（PEDs）是广泛存在的环境污染物，对生殖健康和代谢功能构成威胁。因此，迫切需要能够同时识别和检测这些物质的技术，尤其是对于那些结构相似且经常共存的PEDs。类漆酶纳米酶作为一种环保的催化材料，具有制备简便、稳定性高等优点，能够催化包括酚类在内的多种底物的氧化反应。在本研究中，通过增加氮原子的数量并修改其相对位置，从烟酸衍生物合成了两种新型的羧基化氮杂环-铜配位类漆酶纳米酶（CuINA和Cu2Cl-4PDA）。这些纳米酶增强了比色反应的效果，其颜色强度分别比CuNA高约三倍（CuINA）和两倍（Cu2Cl-4PDA）。此外，它们在广泛的条件下表现出优异的稳定性（pH 4-11、30-90 ℃、0-400 mM NaCl以及7天的储存时间）。随后使用四个传感器单元（CuINA+4-AP、Cu2Cl-4PDA+4-AP、CuINA+2,4-DP+4-AP和Cu2Cl-4PDA+2,4-DP+4-AP）构建了一个比色传感器阵列。结合线性判别分析，该阵列成功识别了浓度范围为10–100 μM的五种PEDs。此外，它还能准确区分混合样品，并表现出很强的抗干扰能力，适用于实际水样，如自来水、湖水和生活污水。此外，通过与机器学习的结合，实现了对五种PEDs的浓度独立检测，克服了对浓度波动的敏感性限制。总体而言，本研究为紧急情况下快速、简单、可靠地识别PED类型和浓度范围提供了一种工具，推进了类漆酶纳米酶的合理设计，并支持了生态系统保护和公共卫生。

引言

酚类内分泌干扰物（PEDs）是一类典型的环境污染物，由于它们对生物体内分泌系统的不良影响而受到广泛关注[1]、[2]、[3]。这些化合物常见于工业过程、家庭产品以及各种环境介质中[4]、[5]。例如，双酚类化合物[6]、[7]可以通过包装材料迁移到食物中，或通过废水排放进入水生环境，最终通过摄入、吸入或皮肤吸收在人体内积累[8]、[9]。己烯雌酚（DES）是一种烯烃分子，与BPA相比，是一种结构上更活跃的酚类内分泌干扰物[10]、[11]、[12]。相关的排放标准进一步强调了识别PEDs的紧迫性。例如，《合成树脂工业污染物排放标准》（GB 31572-2015）将双酚A的间接排放上限设定为≤0.5 mg/L[13]。美国环境保护局的排放限值指南（ELGs）要求尽量减少类似物如双酚F（BPF）和双酚S（BPS）的排放[14]。这些物质在环境中经常共存，并具有相似的化学结构，这使得它们的识别变得复杂[15]。因此，开发简单有效的策略来同时识别和检测结构相似的PEDs既是必要的，也是紧迫的。

在水样中识别和检测PEDs通常面临多种挑战，包括pH值波动、温度变化、共存离子和有机干扰物[16]、[17]。迄今为止，已经开发了多种分析方法来同时检测多种酚类内分泌干扰物。例如，Alampanos等人报道的高效液相色谱-光电二极管阵列（HPLC-PDA）分析方法具有高检测精度，但需要专业操作人员，并且涉及复杂且耗时的样品预处理[11]；Huang等人开发了磁性分子印迹聚合物（MMIPs），结合HPLC-UV检测，用于同时测定己烯雌酚、壬基酚和BPA[18]。然而，分子印迹材料的制备过程繁琐，且其特异性容易受到复杂基质的影响；Li等人开发了一种基于荧光适配体的传感平台，用于同时检测17β-雌二醇、BPA和己烯雌酚[19]。然而，这项技术仍容易受到温度和pH等环境因素的影响。基于纳米酶的比色传感器阵列因其快速响应、操作简便以及能够区分结构相似的分析物而成为一种有前景的替代方案。

纳米酶是一类具有内在酶样催化活性的纳米材料，近年来在分析和检测应用中显示出巨大潜力[20]、[21]。其良好的稳定性使其能够承受pH值和温度等环境变化。其中，基于铜的类漆酶纳米酶被视为环保的催化材料[22]、[23]，能够催化包括酚类和芳香胺在内的多种底物的氧化反应，从而在检测酚类化合物方面具有独特优势[24]、[25]、[26]。传感器阵列代表了一种多通道检测技术，集成了多个传感元件，为区分复杂混合物中的结构相似污染物提供了有效解决方案[27]、[28]。与依赖“一对一”特异性的单一传感器不同，传感器阵列不需要在各个单元中追求高选择性[29]、[30]。目前，由于在快速、简单和多功能检测多种分析物方面的优势，视觉传感器阵列被广泛用于复杂污染物和实际样品的识别[31]、[32]、[33]。特别是在识别和检测酚类污染物方面，它们发挥了重要作用。例如，Wei等人利用基于两种发光金属有机框架（MOFs）的荧光传感器阵列来筛选和识别双酚类化合物[34]；李的团队构建了pH依赖型传感器阵列，用于识别各种卤代酚类污染物[24]。结合机器学习可以通过构建多信号分析模型来提高传感器阵列的检测精度[35]、[36]。随机森林（RF）作为集成学习的典型例子，由于其独特的算法特性，已成功应用于各种多传感器识别场景[37]、[38]、[39]、[40]。随机森林算法通过自助采样和特征随机选择组合多个独立决策树构建而成。通过使用带有替换的自助采样从原始数据集中生成多个子样本，可以减轻单个样本噪声对模型的影响。每个决策树仅随机选择一部分特征进行分割，从而增强了树模型的多样性并降低了过拟合的风险[41]。因此，基于类漆酶纳米酶构建比色传感器阵列并结合机器学习算法，可以通过基本的比色法实现对PEDs的定性或半定量分析。这种方法响应迅速、操作简单快捷，无需复杂的样品预处理步骤或专用仪器，同时表现出优异的稳定性。

氮原子的数量和空间排列在调节类漆酶纳米酶的催化活性方面起着关键作用[42]。Li等人证明，氮原子的配位数显著影响钴原子在含氧物种上的吸附行为，从而调节其酶样活性[43]；Wang等人也证明，高氮含量增强了纳米酶对底物的亲和力[44]；Wei的团队发现，配体苯环上的取代基团位置（例如，对位NH₂、邻位OH）显著影响其谷胱甘肽过氧化物酶样（GPx）活性[45]。为了更接近天然漆酶活性位点中的三核铜簇，最近的研究越来越多地关注不对称配体系统的设计[23]。我们之前使用烟酸（一种不对称配体）合成了CuNA纳米酶，并将其用于快速检测环境水样中的总酚含量[46]。在此基础上，我们提出了两种提高催化活性的策略：（1）修改烟酸中氮原子相对于羧酸基团的相对位置；（2）增加配体结构中的氮原子数量。

如图1所示，我们通过改变氮原子的位置并增加氮原子的数量，筛选了异烟酸和3,6-二氯吡啶嗪-4-羧酸配体。通过与醋酸铜一水合物配位，我们制备了两种羧基化氮杂环-铜配位类漆酶纳米酶（CuINA和Cu2Cl-4PDA），其催化活性高于CuNA。类漆酶纳米酶可以催化酚类物质与4-AP之间的偶联比色反应。CuINA和Cu2Cl-4PDA在不同程度上催化不同PEDs与4-AP之间的比色反应，产生明显的颜色差异。此外，将不同的PEDs引入CuINA+2,4-DP+4-AP和Cu2Cl-4PDA+2,4-DP+4-AP体系中，会产生明显的响应变化。因此，基于五种PEDs在四个通道（CuINA+4-AP、Cu2Cl-4PDA+4-AP、CuINA+2,4-DP+4-AP和Cu2Cl-4PDA+2,4-DP+4-AP）上的不同响应模式，构建了一个多通道比色识别平台。该传感器阵列能够实现五种PEDs的定性识别和半定量检测。通过将传感器阵列与机器学习结合，实现了对五种PEDs的浓度独立识别。此外，其抗干扰性能得到了验证，显示出在实际水体中的应用潜力。总体而言，本研究为环境中的PEDs识别提供了一种非常有前景的策略。

化学物质和材料

本研究使用了以下化学物质和试剂：烟酸（NA）、2-吡啶羧酸（PA）、异烟酸（INA）、3,6-二氯吡啶嗪-4-羧酸（2Cl-4PDA）、醋酸铜一水合物、2,4-二氯苯酚（2,4-DP）、2-(N-吗啉基)、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、4-氨基安替比林（4-AP）、己烯雌酚（DES）、双酚A（BPA）、双酚B（BPB）、双酚F（BPF）、双酚S（BPS）、酚、儿茶酚、氢醌、间苯二酚、4-氯酚

羧基化氮杂环-铜配位类漆酶纳米酶的设计和性质

结构相似的PEDs之间的区分依赖于纳米酶的特定响应，配位结构的空间配置和电子性质对于实现这一功能至关重要。我们选择了羧基化氮杂环-铜配位结构来制备纳米酶，模仿天然漆酶的活性位点，为PEDs的氧化提供了天然的酶样催化环境[47]、[48]、[49]、[50]。具有共轭芳香结构的PEDs

结论

本研究探讨了具有不同氮原子数量和空间配置的配体结构对类漆酶纳米酶催化性能的影响，成功合成了两种具有优异催化性能的类漆酶纳米酶（CuINA和Cu2Cl-4PDA）。CuINA和Cu2Cl-4PDA在不同程度上催化不同PEDs底物与4-AP之间的比色反应。此外，将不同的PEDs引入CuINA+2,4-DP+4-AP和Cu2Cl-4PDA+2,4-DP+4-AP体系中，会产生

环境影响

酚类内分泌干扰物（PEDs）普遍存在，结构相似且共存，对水生生态系统、食物链和人类健康构成威胁。传统方法受到复杂预处理、专用设备或在实际条件下稳定性差的限制。本研究开发了两种新型的羧基化氮杂环-铜配位类漆酶纳米酶（CuINA和Cu2Cl4-PDA）和一个四通道比色传感器阵列。该传感器阵列可以同时

CRediT作者贡献声明

李永新：撰写——审稿与编辑、监督、方法论、资金获取、概念化。黄辉：撰写——初稿、验证、监督、概念化。韩青：验证、监督、概念化。陈希星池：验证、监督、概念化。王学松：验证、监督、概念化。李凯：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、方法论、数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（22176069和22576079）和吉林省自然科学基金（20250202071NC）的财政支持。