亮点
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Tau（243-386）仅在线粒体浓度低于135 mM时发生液-液相分离（LLPS）。
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在蛋白质凝聚体内，淀粉样纤维的生成得到促进，其形成过程遵循成核依赖聚合（NDP）机制。
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在纤维内部，蛋白质分子的结构和局部稳定性在LLPS与非LLPS条件下有所不同。
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LLPS条件能够调节Tau蛋白淀粉样纤维的结构异质性。
1.简介
蛋白质及其他生物分子的液-液相分离（LLPS）现已被认为是一种普遍现象[1]。许多细胞过程在多种无膜细胞器中发生，这些细胞器是由细胞内发生LLPS的生物分子形成的凝聚体[2]。将生理上重要的生物分子高浓度地隔离在此类凝聚体内，似乎有助于细胞过程的进行。类似地，将疾病相关蛋白隔离起来似乎也会促进它们的聚集，包括形成淀粉样纤维[3, 4]。与许多存在于无膜细胞器中的蛋白质一样，与神经退行性疾病相关的蛋白，包括FUS、TDP-43、α-突触核蛋白、朊蛋白和Tau，都含有内在无序区域，这些区域横跨其序列的一部分或全部，已知在实现LLPS中起着关键作用[5]。
关于LLPS如何调节疾病相关蛋白形成淀粉样纤维，仍有许多尚待了解[6, 7]。这些蛋白形成的淀粉样纤维的一个特征是它们的结构异质性。同一种蛋白质可以形成结构彼此独特且不同的纤维[8]，并且在in vitro条件下，纤维形成过程中可能会暂时形成多种不同的结构[9, 10]，之后才由一种结构主导。不同的纤维状结构构成了纤维毒株和物种屏障的基础[11, 12, 13]。因此，理解不同纤维形态的起源，以及细胞因子（如肝素[14]）和LLPS等现象如何调节结构异质性至关重要。这样做已变得势在必行，因为同一种蛋白质形成的纤维状聚集体，其结构总是与它们所关联的不同疾病具有区别性[15, 16]。尽管in vitro条件下形成的纤维可能与in vivo条件下形成的不同[14]，但只有in vitro研究才能揭示LLPS如何调节纤维形成反应中固有的结构异质性。
Tau蛋白在细胞中的主要功能是调节微管组装[17, 18]，但它也能形成与阿尔茨海默病和各种其他Tau蛋白病相关的淀粉样纤维细胞内沉积物[19, 20]。对于每一种疾病，在患病大脑中发现的纤维结构都是独特的[15]，但对其原因和机制知之甚少。Tau蛋白的淀粉样纤维形成已被广泛研究，并显示是通过成核依赖性聚合机制发生的[21, 22, 23]。从in vitro研究中，我们已对环境影响因子[24, 25]、翻译后修饰[20]和突变[26]如何调节该过程有了较多了解，最近还了解了纤维结构如何取决于其in vitro形成条件[14, 27]。
全长Tau蛋白[28, 29]以及包含微管结合区域的截短形式[30]都具有很高的发生LLPS和形成蛋白质凝聚体的倾向。Tau的LLPS被认为主要由吸引性静电相互作用驱动[28]，尽管在非常高的盐浓度下疏水相互作用变得重要[31]。In vitro研究总是需要存在分子拥挤剂，这些研究表明Tau的LLPS如何受到核酸[32, 33]、金属离子[34]、其他分子[35, 36]以及其他神经退行性疾病相关蛋白[37]的调节。
LLPS在脑中致病性Tau聚集（导致Tau蛋白病）中的作用尚未完全确定。Tau的LLPS似乎因疾病相关突变而增强；然而，它导致的是形成非纤维状的致病性聚集体，而非纤维状聚集体[38]。磷酸化Tau形成的凝聚体已被证明可成熟为硫磺素S（ThS）阳性、富含β-折叠的无定形聚集体[39]。在LLPS条件下，致病性突变体变种的Tau纤维形成得到增强，但需要肝素来诱导[40, 41]。据报道，静电驱动的LLPS和淀粉样聚集是独立的过程，尽管同时发生，但疏水相互作用驱动的LLPS促进了纤维形成[31, 42]。显然，Tau蛋白的LLPS与纤维形成之间的联系需要进一步研究。
这种联系一直难以建立，因为Tau以及其他疾病相关蛋白的LLPS和纤维形成，几乎总是在不同的条件下进行研究[43]。即使在LLPS条件下观察到纤维形成，关于它们是在凝聚体内部[39, 41, 44, 45]、凝聚体界面[46, 47, 48]、凝聚体外部[49]形成，还是始于外部并在界面和凝聚体内部进行[50]，仍存在争议。无论纤维在哪里形成，了解凝聚体形成是否可能是纤维异质性的来源都十分重要[43]。例如，已知其他类型的相分离凝聚环境，如脂质微区，可以选择特定的构象并促进淀粉样β蛋白（Aβ）的组装[51]。确定在LLPS条件下和恰好跨越相边界、非常相似的非LLPS条件下形成的纤维，其结构是否不同，将为它们形成的位置提供线索，更重要的是，为纤维结构如何被调节提供线索。
在本研究中，在LLPS以及非常相似但非LLPS的条件下，研究了Tau变体Tau（243-386）的LLPS和纤维形成。目的是研究LLPS的发生如何影响聚集动力学以及纤维结构和异质性。氢-氘交换结合质谱（HDX-MS）研究表明，在LLPS条件下形成的纤维的结构和分段局部稳定性与非LLPS条件下形成的不同，并且结构异质性的程度也不同。在LLPS和非LLPS条件下，纤维形成的动力学被发现是不同的，但纤维形态并无差异。
2.研究结果
2.1在低离子强度条件下，Tau（243-386）经历辅因子驱动的LLPS
Tau（243-386）是最长的人类Tau亚型2N4R的截短变体，包含四个重复结构域（R1-R4）以及序列中紧随其后的18个连续氨基酸残基。其序列涵盖了从不同Tau蛋白病患者大脑中提取的大多数Tau聚集体[15]以及in vitro条件下形成的纤维[52, 53]的核心区域，这使其对于研究Tau的LLPS和聚集机制非常有价值。
2.2Tau（243-386）凝聚体随着老化经历从液态到固态的转变
在100 mM NaCl存在下形成的肝素诱导的凝聚体（图2a）在老化初期表现出液态特性。可以观察到快速的融合事件（图2b）。随着凝聚体老化，观察到的融合事件减少，表明它们正在失去液态特性，变得更像固态。在无NaCl条件下形成的凝聚体也得到了类似的结果（图S4a和b）。
为了量化其液态特性的丧失，在100 mM NaCl存在下，在不同老化时间点对肝素诱导的凝聚体进行了荧光漂白后恢复（FRAP）实验。在老化早期（~0.5小时），凝聚体是高度流动的，在漂白区域观察到约60%的荧光恢复（图2c和d）。随着老化时间延长，荧光恢复的程度减少。在老化约8小时后，未观察到荧光恢复，表明蛋白质分子失去了在凝聚体内的运动性。荧光恢复丧失的特征时间与淀粉样纤维形成的特征时间相似（图2c和d），表明凝聚体内部蛋白质的固化和淀粉样纤维的形成是同时发生的相关过程。
2.3淀粉样纤维形成在Tau（243-386）凝聚体内得到促进
在100 mM NaCl中形成的凝聚体老化过程的不同时间点拍摄的荧光显微镜图像揭示了渐进性的形态变化。最初形成的凝聚体呈球形，直径为1至10微米。随着融合事件的发生，可以观察到直径达30微米的球形凝聚体，尽管大多数仍保持在10微米或更小的尺寸。随着凝聚体进一步老化，它们在尺寸上表现出更大的异质性，以及结块和不规则形状（图3a）。在老化约4小时后，在凝聚体内部出现了硫磺素T（ThT）染色阳性结构。在老化8小时后，观察到明亮的、定义明确的ThT阳性结构出现在凝聚体内部（图3a）。值得注意的是，凝聚体内部的ThT荧光是均匀分布的（图3a），这表明淀粉样纤维的形成并非局限于凝聚体的界面，而是发生在整个凝聚体内部。这与早期关于FUS和TDP-43的研究一致，这些研究表明淀粉样纤维形成发生在凝聚体内[44, 45]，但与其他关于Tau的研究不同，后者表明纤维形成发生在凝聚体界面[46, 48]。
在老化早期，在凝聚体内部观察到弱的、弥漫的硫磺素S（ThS）荧光，随着老化时间的延长，荧光强度增加（图S5）。同样，在整个凝聚体内部观察到均匀的ThS荧光分布。在老化约8小时后，在凝聚体内部观察到具有明亮ThS荧光的线状结构（图S5）。这些结构与纤维结构一致，正如透射电子显微镜（TEM）在相同老化时间点的样品中所显示的那样（图3b）。在老化约8小时的凝聚体中，TEM图像显示了与无定形物质相关的线状结构，进一步证实了淀粉样纤维是在凝聚体内部形成的（图3b）。
2.4在存在LLPS的情况下，Tau（243-386）的纤维形成被加速
研究液相凝聚体的存在如何影响Tau（243-386）聚集成淀粉样纤维，并与无凝聚体存在下的聚集进行比较，是非常重要的。由于在100 mM NaCl存在下凝聚体形成的Csat值约为10 μM（图1a），而在无NaCl存在下约为4 μM（图S2a和b），超过90%的100 μM蛋白质将位于凝聚体内。因此，在LLPS条件下的Tau（243-386）纤维形成是在100 μM蛋白质浓度下进行的，以便在凝聚体内部有足够高的蛋白质局部浓度。在150 mM NaCl（非LLPS条件）下，在相同的100 μM蛋白质浓度下也进行了纤维形成，以便与LLPS条件下的纤维形成进行比较。在100 mM NaCl（LLPS条件）和150 mM NaCl（非LLPS条件）下，纤维形成都随着时间显示出硫磺素T（ThT）荧光的增加（图4a）。然而，在100 mM NaCl下，ThT荧光增加发生得更快，滞后期（tlag）约为3.5小时，而在150 mM NaCl下，滞后期约为5.5小时（图4b）。在两种条件下，ThT荧光增加的动力学都可以用S形曲线很好地拟合（图4a），这表明纤维形成遵循成核依赖聚合（NDP）机制。在100 mM NaCl下的特征时间（τ）为2.1±0.3小时，而在150 mM NaCl下为2.8±0.5小时（图4b）。在100 mM NaCl下，观察到反应结束时单体浓度较低，为4.2±0.7 μM，而在150 mM NaCl下，单体浓度为5.8±0.4 μM（图S7）。这对应于在100 mM NaCl条件下，最终有超过95%的蛋白质聚集，而在150 mM NaCl条件下，最终聚集的蛋白质超过94%。在两种条件下形成的聚集物在硫磺素T结合和远紫外圆二色性（CD）光谱方面表现出相似的特征（图S8a和b）。然而，在100 mM NaCl条件下形成的纤维显示出更强的刚果红（Congo red）结合（图S8c），表明它们可能含有更多的淀粉样结构。在两种条件下形成的纤维的傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示出相似的谱带位置（图S9），表明在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维具有相似的整体二级结构。
2.5通过氢-氘交换质谱（HDX-MS）对纤维进行结构表征
为了深入了解在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维的内部结构，采用HDX-MS对纤维进行了表征。在HDX-MS研究中，将在H2O缓冲液中形成的纤维转移到D2O缓冲液中。非结构化或具有弱结构的酰胺氢位点会被氘标记。通过在低pH淬火条件下进行蛋白质酶解，并确定哪些片段显示出氘掺入增加，可以识别出被标记的片段。然后，通过比较在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维之间每个片段的氘掺入情况，可以推断出结构差异。
在HDX反应10秒后，在非LLPS条件下形成的纤维中，观察到Tau（243-386）的几个片段显示出显著的氘掺入，表明这些片段是结构松散或未折叠的。在残基267-284、285-307、308-314、316-346、347-357和358-380对应的片段中观察到低氘掺入，表明这些区域是纤维核心的一部分，并且具有稳定的结构。在LLPS条件下形成的纤维中，在残基267-284、285-307、308-314、316-346、347-357和358-380对应的片段中也观察到低氘掺入，表明这些区域也是纤维核心的一部分。然而，在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维之间，氘掺入的程度有所不同，表明在两种条件下形成的纤维中，这些片段的结构和稳定性是不同的。
为了量化在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维之间的结构差异，计算了每个片段的氘掺入百分比差异（图5）。在残基285-307、316-346、347-357和358-380对应的片段中观察到最大的差异，在LLPS条件下形成的纤维中，这些片段的氘掺入显著更高。这表明，在LLPS条件下形成的纤维中，这些片段的结构稳定性较低，或者说更动态/无序。在残基267-284和308-314对应的片段中，在两种条件下形成的纤维之间，氘掺入的差异最小，表明这些区域是纤维核心中最稳定的部分，并且不受LLPS条件的显著影响。
2.6Tau（243-386）纤维的形态表征
为了确定在LLPS和非LLPS条件下形成的Tau（243-386）纤维是否具有不同的外部形态，使用透射电子显微镜（TEM）对纤维进行表征（图S14）。获取了在LLPS和非LLPS条件下由100 μM蛋白质形成的纤维的TEM图像。TEM成像显示，在150 mM和100 mM NaCl存在下形成的纤维是相似地短而直，与早期报告一致[52, 60]。另一方面，在无盐条件下形成的纤维更长且更弯曲（图S14）。在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维之间没有观察到形态上的显著差异，表明外部形态不受相分离条件的显著影响。
3.讨论
阐明纤维异质性的结构和机制基础非常重要，因为神经退行性疾病相关蛋白的不同纤维状构象可能具有不同的致病性。多种纤维形态可以在不同的聚集条件下产生[63, 64]，或在相同条件下产生[14, 65]，或通过在相同条件下的多种聚集途径产生[66, 67]，或由于小分子共溶质的调节而产生[68, 69]。在神经退行性疾病中，经常同时看到蛋白质凝聚体和纤维[70, 71]。然而，LLPS如何调节淀粉样纤维形成，特别是纤维的结构和异质性，仍然是一个开放性问题。目前的研究通过比较在LLPS条件和非LLPS条件下形成的纤维的结构，解决了Tau蛋白的这个基本问题，其中非LLPS条件与LLPS条件仅在盐浓度上有所不同，恰好跨越了相边界。
3.1LLPS条件下纤维形成的调节
Tau的LLPS和纤维形成都在低盐浓度下更有利，并且很难确定这两个过程是否彼此独立发生[41, 42]，特别是因为纤维形成的临界浓度与凝聚体形成的阈值浓度Csat相同（图1，图4）。关于淀粉样纤维是在凝聚体内部[45]、在凝聚体界面形成，还是在凝聚体外部形成，有几个观察结果与这个问题相关。目前的观察表明，淀粉样纤维在整个凝聚体内部形成，并且它们的形成遵循成核依赖聚合机制。此外，纤维形成的动力学在LLPS条件下更快，因为凝聚体内部的蛋白质局部浓度更高。在非LLPS条件下，由于本体蛋白质浓度较低，纤维形成较慢。然而，在两种条件下，最终聚集的蛋白质百分比相似，表明在两种条件下，纤维形成的效率是相似的。
3.2凝聚体内淀粉样纤维形成的机制
众所周知，在没有LLPS的情况下，Tau的淀粉样纤维反应通过成核依赖聚合机制（NDP）进行，其中初级成核和次级成核都可能发生[21, 22, 23]。这从总是观察到的纤维形成的S形动力学中可以明显看出。观察发现凝聚体内的纤维形成也遵循S形动力学，这有力地表明它在蛋白质凝聚体内也通过NDP机制发生。在这种机制中，初始成核步骤是限速步骤，随后是纤维的快速延伸。在凝聚体内，高局部蛋白质浓度降低了成核的能垒，导致成核速率更快，从而纤维形成更快。这得到了观察结果的支持，即在LLPS条件下，纤维形成的滞后期和特征时间都比在非LLPS条件下更短。
3.3LLPS和非LLPS条件下形成的纤维，其核心最稳定区域相同
序列片段267-284和308-314受到强烈保护，因此在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维中，氢-氘交换（HDX）程度都很低（图5，图6，表1）。序列片段267-284属于R1和R2，并包含PHF6，而序列片段308-314属于R3，并包含PHF6。已知与Tau中残基270-290结合的肝素[56, 76]，在纤维形成过程中将Tau分子组装在一起[22]。它通过暴露PHF6和PHF6基序，诱导出一种易于聚集的构象[77]。这些片段是Tau蛋白淀粉样纤维核心的一部分，并且已知是形成交联β-折叠结构的关键[15, 78]。这些片段在LLPS和非LLPS条件下都表现出高度保护，表明它们是纤维核心最稳定的部分，并且不受相分离条件的显著影响。
3.4LLPS对纤维结构异质性和稳定性的调节
观察到在组成纤维的蛋白质分子中，一些片段（285-307、316-346、347-357和358-380）要么高度稳定，要么弱/中度稳定（见结果部分），这表明这些片段在组成纤维的不同蛋白质分子群体中结构上是不同的。正是因为这些片段的结构彼此不同，它们赋予了抗HDX的不同程度的稳定性（高对比弱/中度）。在LLPS条件下形成的纤维中观察到的这种结构异质性，与非LLPS条件下形成的纤维中观察到的不同。在LLPS条件下形成的纤维中，片段285-307、316-346、347-357和358-380表现出更高的氘掺入，表明它们在这些纤维中的稳定性较低。这表明，在LLPS条件下形成的纤维中，这些片段的结构更多样化，或者说更动态。在非LLPS条件下形成的纤维中，这些片段表现出较低的氘掺入，表明它们更稳定，结构更均一。
3.5LLPS条件下纤维核心结构的调节。
在HDX-MS研究中，纤维的结构核心可以被识别为跨越一个显示中度到高度抗交换稳定性的连续序列区域。在LLPS条件下（100 mM NaCl），核心最稳定的部分（由对HDX的高度稳定性定义）是从残基267到307的序列区域，存在于36%的纤维中，而在非LLPS条件下，这个核心存在于65%的纤维中（图6）。将这种由HDX-MS检测到的异质性与通过固态核磁共振（ssNMR）和冷冻电子显微镜（cryo-EM）在从阿尔茨海默病患者大脑中提取的Tau纤维中观察到的结构多态性进行比较是有启发性的[15, 79]。在患者来源的纤维中，核心区域通常跨越残基约305-380，但在不同的纤维菌株中，核心的确切边界和构象是不同的[15, 80]。目前的研究表明，LLPS可以选择性地促进特定结构多态性的形成，从而调节纤维的异质性。
4.结论
本研究探讨了Tau（243-386）在LLPS相边界（135 mM NaCl）两侧形成的淀粉样纤维的生长和结构。在LLPS条件下，淀粉样纤维形成通过NDP机制发生在凝聚体内部各处。在非LLPS条件下，它也通过NDP机制发生，但由于蛋白质浓度较低，发生速度较慢。在LLPS和非LLPS条件下形成的纤维都由结构异质的蛋白质分子组成，但异质性的程度在两种条件下是不同的。在LLPS条件下形成的纤维中，核心区域的结构更多样化，而在非LLPS条件下形成的纤维中，核心区域更均一。这些结果表明，LLPS可能通过选择性地促进特定结构多态性的形成来调节Tau蛋白淀粉样纤维的结构异质性。
