《LWT》：Dual-frequency ultrasonic-assisted extraction of pumpkin polysaccharides: Process optimization, structural characterization, and antioxidant activity
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本研究针对常规南瓜多糖(PP)提取技术效率低、易导致结构降解的问题，创新性地应用双频超声辅助提取(DF-UAE, 20/40 kHz)策略。研究发现，DF-UAE不仅显著提升了多糖提取率与总糖含量，还更好地保留了高分子量组分和糖醛酸结构，从而获得了抗氧化活性更强的多糖，并通过结构-活性关系分析揭示了其作用机制。这项工作为功能性食品领域高效、可持续地生产高品质南瓜多糖提供了新策略。
南瓜（Cucurbita moschata Duch.）作为一种药食同源的作物，富含多种生物活性成分，其中南瓜多糖（Pumpkin Polysaccharides, PP）因其广泛的生物功能（如抗氧化、抗炎、免疫调节等）而备受关注。然而，传统的热水提取法（Hot-Water Extraction, HWE）存在提取效率低、能耗高、提取时间长，且在高温作用下可能导致多糖链降解、生物活性丧失等问题。为了克服这些局限，开发高效、绿色且能更好地保护多糖天然结构的提取技术成为研究热点。超声辅助提取（Ultrasonic-Assisted Extraction, UAE）作为一种新兴的物理场强化技术，通过其特有的空化效应，能够有效破坏植物细胞壁，促进内容物释放，具有提高效率、降低溶剂用量和能耗的潜力。其中，超声频率是影响空化强度、气泡动力学及最终提取效果的关键参数，而将不同频率超声波协同使用的双频超声辅助提取（Dual-Frequency UAE, DF-UAE）策略，能否在高效提取的同时更好地保护多糖的精细结构，并进一步提升其生物活性，其内在机理尚不明确。为此，来自吉林化工学院的研究团队在《LWT - Food Science and Technology》期刊上发表了一项研究，系统探究了双频超声辅助提取南瓜多糖的工艺、机制及其产物特性。
本研究主要采用了双频超声辅助提取（DF-UAE）技术作为核心提取方法，并与传统热水提取法（HWE）进行对比。通过单因素实验和Box-Behnken设计（BBD）响应面法对提取工艺参数（液固比、时间、功率、温度）进行优化。提取得到多糖后，采用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）、热重分析（TGA）等技术分析了原料及残渣的微观结构与理化性质变化，以揭示提取机制。对提取的多糖本身，则通过高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定分子量分布，采用高效液相色谱（HPLC）分析单糖组成，并利用原子力显微镜（AFM）、圆二色光谱（CD）等技术进行形貌和高级结构表征。此外，通过2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）和羟基自由基（•OH）清除实验评估了多糖的体外抗氧化活性。最后，对最优条件下得到的多糖进行了分离纯化，并通过甲基化分析和核磁共振（NMR）谱学技术解析了其精细化学结构。
3.1. 超声频率对提取效率及抗氧化特性的影响
研究人员比较了不同单频（20, 40, 53 kHz）和双频（20/40, 20/53 kHz）超声辅助提取与HWE的效果。结果表明，20/40 kHz DF-UAE取得了最高的提取率（21.55 g/100g），是HWE的1.78倍。同时，DF-UAE提取的多糖具有最高的总糖含量、蛋白质含量、糖醛酸含量以及最高的重均分子量（Mw 219.3 kDa），而HWE提取的多糖分子量仅为32.4 kDa。在抗氧化活性方面，DF-UAE提取的多糖对ABTS和•OH自由基的半数抑制浓度（IC50）最低，活性最强。相关性分析表明，抗氧化活性与多糖的分子量、糖醛酸及蛋白质含量呈显著负相关，即这些值越高，抗氧化能力越强。机理上，20/40 kHz的双频组合（频率比2:1）形成了异质声场，低频（20 kHz）产生的高能空化泡利于破壁，高频（40 kHz）产生的均匀空化则促进多糖可控释放，二者协同实现了高效率与低降解的平衡。
3.2. 机制探究：UAE与HWE的对比
通过扫描电镜（SEM）观察发现，DF-UAE处理后的南瓜残渣细胞壁破裂严重，形成大量空洞和粗糙表面，而HWE残渣仅有部分裂痕，表明超声空化对细胞结构的物理破坏更彻底。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和X射线衍射（XRD）分析显示，DF-UAE没有改变多糖的主要化学键，但显著降低了残渣的结晶度。热重分析（TGA）表明DF-UAE能更有效地提取出热不稳定多糖。这些结果共同证实，DF-UAE通过强烈的空化效应增强了细胞壁的渗透性和破坏程度，从而大幅提升了多糖的溶出效率。
3.3. 超声辅助提取工艺优化
通过单因素实验确定了各参数的近似最优范围，进而采用Box-Behnken设计（BBD）进行响应面优化。建立了提取率与液固比、提取时间、超声功率和提取温度的四因素二次回归模型。模型分析表明提取时间的影响最显著。优化得到的最佳工艺条件为：液固比43 mL/g，时间39 min，超声功率180 W，温度62 °C。在此条件下进行验证实验，提取率达到40.51 g/100g，与模型预测值高度吻合。
3.4. 经济与环境效益评估
与HWE相比，DF-UAE在多个方面展现出巨大优势。其比能耗（Specific Energy Consumption, SEC）降低了90%（12.4 vs. 124 kWh/kg），相应的二氧化碳排放量也减少了90%（5.79 vs. 57.9 kg CO2/kg）。经济性评估显示，尽管双频超声设备需要更高的初始投资，但由于其提取率大幅提升和能耗显著降低，在假设的工业生产场景下，投资回收期可短至约8个月，具备良好的经济可行性。
3.5. 不同方法提取多糖的结构与理化性质表征
对最优DF-UAE和HWE提取的粗多糖进行了系统的结构表征。化学组成分析证实DF-UAE多糖的总糖含量更高。单糖组成分析表明两者均为含有甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的杂多糖，但比例有差异。高分子量分布（HPGPC）分析再次确认DF-UAE多糖的分子量远高于HWE多糖，且高分子量组分（>100 kDa）比例是后者的近8倍。扫描电镜（SEM）和原子力显微镜（AFM）显示DF-UAE多糖形貌更疏松、分散更均匀。X射线衍射（XRD）表明两者均为无定型结构，DF-UAE多糖有序度更低。热分析显示DF-UAE多糖具有更高的热稳定性。刚果红实验和圆二色谱（CD）分析表明，两种多糖均存在螺旋构象，但DF-UAE对多糖的高级结构产生了可控的修饰，使其螺旋堆积更为松散。
3.6. 多糖的分离纯化与精细结构解析
将DF-UAE所得粗多糖经脱蛋白、阴离子交换色谱（DEAE-Sepharose）和凝胶过滤色谱（Sephacryl S-100）纯化，得到一个主要均一多糖组分PPs2。其重均分子量为254 kDa，单糖主要由半乳糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖构成。甲基化分析揭示了PPs2中丰富的糖苷键连接类型，包括→3)-Galp-(1→, →3,6)-Galp-(1→, →5)-Araf-(1→等，表明其为高度支化的结构。综合一维和二维核磁共振（NMR）（包括 1H, 13C, DEPT-135, COSY, HSQC, HMBC, NOESY）谱图解析，最终确定PPs2是一种以鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-I（Rhamnogalacturonan-I, RG-I）型果胶杂多糖为主链，连接有阿拉伯半乳聚糖侧链的复杂结构。
结论与意义
本研究表明，双频超声辅助提取（DF-UAE, 20/40 kHz）是一种高效、节能且可持续的南瓜多糖提取新技术。与传统的热水提取法相比，DF-UAE不仅能将提取率提高1.78倍，比能耗降低90%，还能更好地保护多糖的高分子量链结构，并富集糖醛酸等功能性基团。这些结构优势直接转化为了更强的体外抗氧化活性，且活性与分子量、糖醛酸含量等结构参数显著相关。通过深入的微观结构、化学组成和高级结构表征，并结合甲基化与核磁共振分析，研究首次清晰揭示了DF-UAE提取的南瓜多糖的精细化学结构，并阐明了双频超声协同空化“高效破壁、低度降解”的作用机制。这项工作不仅为南瓜多糖的高值化利用提供了一种具有工业化前景的绿色提取方案，所阐明的结构-活性关系也为设计与开发具有特定生物活性的功能性多糖产品提供了重要的理论依据和实践指导。
