《Cancer Science》：SMURF1 Regulates CTCF-HOXA10 Axis and Promotes Tumor Progression in Nasopharyngeal Carcinoma
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本研究揭示了一个新的鼻咽癌（NPC）致癌信号轴：E3泛素连接酶SMURF1通过促进CTCF的K48-连接泛素化降解，解除了CTCF对HOXA10的转录抑制作用，从而驱动肿瘤进展。该发现阐明了HOXA10在NPC中异常上调的机制，并将SMURF1定位为潜在的治疗靶点。
1 引言
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是一种源自鼻咽黏膜的恶性上皮性肿瘤，在东亚和东南亚地区，尤其是中国南方发病率较高。大部分患者确诊时已处于晚期，治疗后复发率高，预后较差。因此，阐明NPC发生发展的分子机制，寻找有效的治疗靶点至关重要。
同源盒基因A10（Homeobox A10, HOXA10）是HOX基因家族成员，在胚胎发育和细胞分化中起关键作用。研究表明，HOXA10在多种恶性肿瘤中异常表达，并促进肿瘤进展。近期研究也表明HOXA10在NPC中高表达，并促进细胞增殖、克隆形成和肿瘤生长。然而，HOXA10在NPC中上调的调控机制尚不完全清楚。
CCCTC结合因子（CCCTC-binding factor, CTCF）是一种高度保守的锌指蛋白，是基因组结构和基因表达的主要调节因子，具有转录激活、抑制和绝缘子活性等多种功能。CTCF在人类癌症中经常失调，通常通过抑制癌基因的转录而发挥肿瘤抑制因子的作用。研究表明，约45%的NPC患者CTCF表达降低，尤其是在晚期疾病中。然而，CTCF在NPC中的具体功能和机制尚未明确。本研究通过生物信息学预测，发现CTCF在NPC中下调，并可能结合到HOXA10启动子区的特定序列。我们因此假设，CTCF可能在正常鼻咽细胞中转录抑制HOXA10，而这种抑制的丧失可能导致NPC中观察到的HOXA10异常上调。
CTCF的稳定性和功能受翻译后修饰的调节，包括泛素化。SMAD泛素化调节因子1（SMAD ubiquitination regulatory factor 1, SMURF1）是一种含有HECT结构域的E3泛素连接酶，在靶向蛋白质进行蛋白酶体降解中起关键作用。先前研究表明，SMURF1在多种癌症类型中作为肿瘤促进因子。然而，SMURF1是否调节CTCF的稳定性尚不清楚。此外，SMURF1在NPC中的作用和潜在机制仍不清楚。
在本研究中，首先验证了HOXA10在NPC中的上调及其促肿瘤功能。进一步确定CTCF是HOXA10的关键转录抑制因子，并发现其在NPC中下调。更重要的是，证明SMURF1介导了CTCF的泛素化和蛋白酶体降解，从而减轻了其对HOXA10表达的抑制作用。最后，通过体外和体内模型，表明SMURF1的促肿瘤效应在很大程度上取决于其对CTCF-HOXA10轴的调节。这些发现揭示了NPC中一个新的SMURF1/CTCF/HOXA10调控轴，为该疾病的分子发病机制提供了新见解，并提出了潜在的治疗干预靶点。
2 材料与方法
研究使用来自贵州医科大学附属医院NPC患者的配对NPC组织和相应的癌旁非肿瘤组织。动物实验使用8周龄雄性Balb/c-nu裸鼠，饲养于无特定病原体（specific pathogen-free, SPF）条件下。建立了NPC皮下异种移植模型和肺转移模型。实验方法包括苏木精-伊红（H&E）染色、免疫组织化学（IHC）、细胞培养、甲基噻唑基二苯基-四唑溴化物（MTT）测定、集落形成测定、流式细胞术、伤口愈合测定、Transwell侵袭测定、免疫荧光测定、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、Western印迹分析、生物信息学预测、染色质免疫沉淀（ChIP）测定、荧光素酶报告基因测定、放线菌酮（CHX）追踪测定、共免疫沉淀（Co-IP）测定和统计分析。
3 结果
3.1 HOXA10在NPC中上调并促进恶性表型
生物信息学分析和临床样本验证一致表明，HOXA10在NPC组织和细胞系中显著上调。在C666-1和CNE2细胞中敲低HOXA10，显著抑制了细胞增殖、集落形成能力，促进了细胞凋亡，并削弱了细胞迁移和侵袭能力。
3.2 CTCF在NPC中下调并抑制HOXA10的转录激活
生物信息学分析和临床样本验证表明，CTCF在NPC组织和细胞系中表达下调。JASPAR数据库预测了CTCF在HOXA10启动子区域的潜在结合位点。ChIP实验证实CTCF富集于NPC细胞的HOXA10启动子区。突变该预测结合位点导致HOXA10表达上调，并降低了CTCF与HOXA10的结合。在NPC细胞中过表达CTCF导致HOXA10表达显著下调，荧光素酶报告基因实验证实CTCF过表达降低了HOXA10启动子活性。因此，NPC细胞中CTCF的下调导致其对HOXA10的转录抑制减弱，从而使HOXA10水平升高。
3.3 SMURF1在NPC中上调并调节CTCF表达
分析表明SMURF1在NPC临床样本和细胞系中表达上调。在NPC细胞中敲低SMURF1导致CTCF表达显著增加，SMURF1表达显著降低。CHX追踪实验表明，敲低SMURF1增强了CTCF蛋白的稳定性，提示SMURF1在转录后水平调节CTCF。
3.4 SMURF1促进CTCF的K48-连接泛素化降解
用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞发现，SMURF1通过蛋白酶体降解途径调节CTCF稳定性。Co-IP实验证实SMURF1与CTCF存在物理相互作用，免疫荧光染色也支持了SMURF1和CTCF的共定位。在MG132存在下，泛素处理导致NPC细胞中CTCF泛素化增加，SMURF1过表达进一步增强了这种泛素化。SMURF1过表达促进了CTCF的K48-连接和K63-连接泛素化，其中K48-连接泛素化增加更为显著。突变CTCF的K48位点显著减弱了SMURF1过表达介导的CTCF泛素化增强，表明K48是SMURF1介导CTCF泛素化降解的关键位点。
3.5 SMURF1在体外促进NPC进展和上皮-间质转化
在NPC细胞中调节SMURF1、CTCF和HOXA10的表达以评估功能变化。敲低SMURF1降低了SMURF1水平，增加了CTCF蛋白水平（不改变其mRNA表达），并降低了HOXA10表达。CTCF过表达进一步增强了敲低SMURF1对增加CTCF蛋白水平和抑制HOXA10表达的效果。功能实验表明，敲低SMURF1抑制了细胞增殖，促进了细胞凋亡，并抑制了迁移和侵袭，而CTCF过表达进一步增强了这些效应。此外，敲低SMURF1增加了上皮标志物E-钙粘蛋白，降低了间质标志物N-钙粘蛋白；同时过表达CTCF促进了这种效应。这些发现证实了SMURF1在NPC中发挥致癌作用，同时促进上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）。
3.6 敲低SMURF1在体内抑制NPC肿瘤生长和转移
在裸鼠中使用转染了LV-sh-SMURF1或LV-sh-NC的C666-1细胞建立皮下异种移植和肺转移模型。敲低SMURF1显著抑制了NPC裸鼠的肿瘤生长，表现为肿瘤体积和重量减少。此外，敲低SMURF1增加了CTCF蛋白水平（不影响其mRNA水平），同时降低了HOXA10的mRNA和蛋白表达。H&E染色显示，与LV-sh-NC组相比，LV-sh-SMURF1组的肿瘤细胞浸润减少。IHC结果显示，敲低SMURF1降低了SMURF1和增殖标志物Ki67的表达。
在NPC肺转移模型中，敲低SMURF1导致肺组织中转移结节更少、更小。此外，敲低SMURF1提高了CTCF蛋白水平但不影响其mRNA水平，同时下调了HOXA10在肺组织中的mRNA和蛋白表达。IHC进一步证实，与LV-sh-NC组相比，LV-sh-SMURF1组中SMURF1和Ki67的表达降低。总之，SMURF1通过调节CTCF-HOXA10轴促进了NPC裸鼠的肿瘤生长和转移。
4 讨论
本研究阐明了NPC中一个新的致癌信号轴，其中E3泛素连接酶SMURF1促进CTCF的泛素化降解，随后解除了CTCF介导的HOXA10转录抑制，从而驱动肿瘤进展。这些发现不仅揭示了NPC中HOXA10上调的先前未知机制，而且确立了SMURF1作为CTCF稳定性的关键翻译后调节因子，突出了靶向SMURF1/CTCF/HOXA10轴的治疗潜力。
本研究证实的HOXA10异常上调及其在NPC细胞系和临床组织中的促肿瘤功能，与其他恶性肿瘤中的报道一致。本研究通过识别一种新的CTCF介导的转录控制机制，扩展了对NPC中HOXA10调控的理解。本研究的数据强有力地证明，CTCF结合到HOXA10启动子区域，抑制其启动子活性，从而抑制HOXA10表达。这些发现与报道CTCF在小鼠功能异常胚胎植入模型和乳腺癌细胞中转录抑制HOXA10的研究一致。CTCF是一种众所周知的转录调节因子和肿瘤抑制因子，在多种癌症中经常下调。先前证据表明CTCF在晚期NPC中下调，我们的数据集分析、临床样本和细胞模型也证实了这一点。这些结果共同表明，CTCF介导的HOXA10转录抑制的丧失是NPC进展中的一个关键事件。
本研究的另一个关键发现是首次阐明了SMURF1和CTCF在NPC中的新型调控关系。尽管先前研究已证实CTCF受翻译后修饰的调节，但其泛素化机制仍知之甚少。本研究首次揭示，E3泛素连接酶SMURF1负责介导CTCF的泛素-蛋白酶体降解，导致其在NPC中下调。本研究中的Co-IP、免疫荧光和泛素化实验表明，SMURF1直接与CTCF相互作用，并促进其K48-连接泛素化降解。这些发现与先前SMURF1通常介导靶蛋白的K48-连接泛素化的报道一致。值得注意的是，本研究首次将K48确定为CTCF上的一个关键泛素化位点。这一发现显著增进了对CTCF调控的理解。尽管已知CTCF可被其他E3连接酶泛素化，但具体的泛素连接类型仍然未知。K48-连接链的识别（蛋白酶体靶向的典型信号）为SMURF1过表达如何在NPC中驱动CTCF缺失提供了直接的机制解释。除了NPC，这一发现对癌症生物学具有更广泛的意义。鉴于CTCF作为主要基因组组织者和常见肿瘤抑制因子的作用，以及SMURF1在癌症中的普遍过表达，SMURF1-CTCF轴可能代表了在肿瘤发生中灭活CTCF的一种保守途径。从治疗角度来看，精确定位特定的连接类型和位点（K48）为开发靶向策略（如SMURF1抑制剂）以在CTCF缺陷的癌症中恢复CTCF功能奠定了基础。
SMURF1已被证实可促进多种癌症的肿瘤生长。我们的数据表明，敲低SMURF1抑制了NPC细胞的恶性表型，包括减少增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化。体内研究结果进一步揭示，敲低SMURF1显著抑制了NPC裸鼠模型中的肿瘤生长和肺转移。这些结果通过揭示SMURF1在促进NPC肿瘤生长和转移中的作用，扩展了SMURF1已知的功能范围。先前研究表明，SMURF1对于TGF-β诱导的结直肠癌和乳腺癌模型中的上皮-间质转化和肿瘤转移至关重要。据报道，HOXA10通过调节上皮标志物E-钙粘蛋白和间质标志物N-钙粘蛋白的表达来介导上皮-间质转化。我们的数据显示，敲低SMURF1抑制了肿瘤进展，同时增加了CTCF水平并降低了HOXA10水平。本研究创新性地证明，SMURF1通过调节CTCF/HOXA10轴驱动NPC的上皮-间质转化和肿瘤进展。
从治疗角度来看，我们的研究结果表明，靶向SMURF1可能是重新激活CTCF的肿瘤抑制功能并抑制HOXA10驱动的肿瘤进展的可行策略。开发针对SMURF1的小分子抑制剂可能为NPC治疗提供新途径。尽管取得了这些进展，但本研究仍有一些局限性。首先，导致SMURF1在NPC中上调的上游机制尚不清楚。其次，尽管本研究重点关注CTCF对HOXA10的调控，但SMURF1介导的CTCF降解也可能破坏其对其他致癌因子的抑制。未来的研究应致力于识别SMURF1特定的上游调节因子，以全面描绘这一调控回路。此外，筛选或设计针对SMURF1的特异性小分子抑制剂，可能为具有高SMURF1和低CTCF表达的NPC患者提供一种新的治疗策略。
总之，本研究揭示了一个新的SMURF1/CTCF/HOXA10轴，在促进NPC肿瘤生长和转移中起关键作用。这些结果增强了对CTCF泛素化降解调控和HOXA10转录调控的理解，为开发针对NPC的新靶向疗法提供了机制基础。
