《Cancer Science》：Cholangiolocellular Component Predicts a Biologically Distinct Subgroup of Mass-Forming Intrahepatic Cholangiocarcinoma
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本文揭示肿块型肝内胆管癌（MF-iCCA）中胆管细胞癌（CLC）成分的存在，是预后更好的独特分子亚型（iCCA-G1）的关键组织学指标。该亚型以高血管生成、骨桥蛋白（SPP1/OPN）表达上调及不同的致癌通路为特征，为iCCA的分子分型与靶向治疗提供了新见解。
引言
肝内胆管癌（iCCA）是一种起源于肝内胆管上皮的恶性肿瘤，其全球发病率不断上升，但即使是在发达国家，其5年总生存率也极低，约为10%。这凸显了开发新型iCCA治疗策略的紧迫性。基于基因/蛋白表达或特定基因改变的分子亚型分类已被证明是开发乳腺癌、肺癌和结肠癌等疾病治疗策略的成功方法。虽然已有多种基于多基因/蛋白的iCCA分子亚型分类被报道，但除了少数可作为特定药物靶点的基因突变（如FGFR2融合和IDH1/2点突变）外，这些分类尚未广泛应用于临床。此外，携带这些基因突变的患者数量有限，且靶向治疗后出现的耐药问题仍未解决。因此，创建有效的iCCA亚型分类对于获得抗iCCA治疗的新见解至关重要。
与分子亚型分类相比，组织病理学亚型分类是一种经典且经济有效的方法。iCCA目前主要根据肿瘤性导管的大小分为小胆管型和大胆管型两种组织病理学亚型。胆管细胞癌（CLC）最初在1959年被描述为一种罕见的原发性肝脏肿瘤组织学变体，其癌性小导管类似于肝管（canals of Hering）或胆小管。CLC因其独特的组织学结构（肿瘤腺体类似于可能驻留有肝胆干细胞的胆小管）和遗传/蛋白表达模式（如多种整合素分子的下调）而被认为是独特的。在最新的组织学分类版本中，CLC基于其免疫组化和分子特征与高分化iCCA的相似性，被归类为小胆管型iCCA的一部分。病理学家经常在小胆管型iCCA病灶中观察到局灶性CLC成分的存在，但此类病灶的临床病理特征尚未被详细描述。本研究聚焦于具有小胆管组织学的肿块型iCCA（MF-iCCA）中的CLC成分，旨在基于CLC成分的存在，鉴定出具有独特生物学特征的iCCA稳健分子亚型，为iCCA的治疗策略分层奠定基础。
材料与方法
本研究纳入了2003年至2010年间在日本国立癌症研究中心医院（东京）手术切除的36例经组织学证实为小胆管型的MF-iCCA病例，所有病例均有可用的新鲜冰冻样本。收集的新鲜组织样本在-80°C冷冻保存用于后续RNA提取和转录组分析。所有切除组织均经福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）以进行常规组织病理学评估。通过苏木精-伊红（H&E）染色切片评估CLC成分，并根据WHO（2019年）分类的形态学定义确定其存在。将CLC成分超过5%的肿瘤归类为CLC阳性（CLC(+)）iCCA，其余归类为CLC阴性（CLC(-)）iCCA，并由两名病理学家独立评估并达成共识。此外，还提取了包括年龄、性别、肿瘤大小、血管侵犯、淋巴转移、血清肿瘤标志物（CEA, CA19-9）水平以及术后5年复发和生存状态在内的临床病理学信息。
从新鲜冰冻肿瘤样本中提取总RNA，并使用SurePrint G3人类基因表达微阵列芯片进行微阵列分析。数据经过处理和归一化。通过全外显子组测序获取基因改变数据。对FFPE组织块的代表性切片进行免疫组织化学（IHC）分析，使用的抗体包括h-钙调结合蛋白（用于标记不成对动脉和门脉区）、血管生成素-1（用于标记小血管）和骨桥蛋白（OPN）。通过数字切片扫描仪扫描免疫染色切片并进行定量分析。使用t检验、卡方检验、Log-rank检验、Kaplan-Meier生存曲线等进行统计学分析。基因集富集分析（GSEA）用于识别差异富集的通路。
结果
iCCA中的CLC成分可作为预后指标
根据研究设计，36例肿瘤中有14例被分类为CLC(+) iCCA，22例为CLC(-) iCCA。临床病理学分析显示，CLC(+) iCCA在女性患者中更为常见，且患者血清CA19-9的对数转换值显著较低。虽然伴有肝脂肪变的病例数量有限，但脂肪变在CLC(?) iCCA中更常见。CLC(+) iCCA患者的总生存期（OS）显著优于CLC(?) iCCA患者，但无复发生存期（RFS）无显著差异。
CLC(+) iCCA属于预后更好的独特遗传学类别
通过分析CLC(+)和CLC(?) iCCA中的差异表达基因，鉴定出在两类中高表达的基因，并利用这538个基因进行层次聚类，揭示了MF-iCCA的两个不同分子亚组：iCCA-G1和iCCA-G2。iCCA-G1是一个与CLC相关的亚组，包含所有14例CLC(+) iCCA和19例CLC(?) iCCA中的7例；而iCCA-G2是一个与CLC无关的亚组，仅包含12例CLC(?) iCCA。GSEA分析表明，CLC(+) iCCA富集了与胆管细胞、纤维基质、免疫细胞、补体、氧化代谢和骨桥蛋白相关的基因特征，而CLC(?) iCCA则富集了与细胞增殖、DNA修复、缺氧、糖代谢、KRAS信号、TP53信号和WNT信号相关的特征。iCCA-G1与iCCA-G2的比较结果与上述基本相似，但iCCA-G1中需氧/氧化代谢的富集更为显著。此外，将先前报道的Andersen胆管癌分类基因签名应用于本队列，发现预后良好的I类基因集在CLC(+) iCCA中显著富集，而预后不良的II类基因集在CLC(?) iCCA中富集，且基于该基因集的聚类结果与本研究的CLC相关遗传亚组完全重叠。预后分析显示，iCCA-G1肿瘤患者的总生存期和无复发生存期均显著优于iCCA-G2患者，此结果在一个包含30例iCCA病例的公共数据集中得到了验证。
基因改变模式与MF-iCCA的转录组亚组相关
在30例有全外显子组测序数据的病灶中，iCCA-G2的基因改变总数和错义突变数量显著高于iCCA-G1。鉴定出13个常见改变基因。其中，TP53的错义或无义突变在CLC(?) iCCA中的检出率显著高于CLC(+) iCCA，在iCCA-G2中也显著高于iCCA-G1。KRAS突变在iCCA-G2中也更常见。对13个常见改变基因的基因改变频率进行层次聚类显示，CLC(+)G1和CLC(?)G1彼此之间的关系比与CLC(?)G2更密切，表明基于转录组的iCCA-G1和iCCA-G2分类与遗传改变相关。
MF-iCCA中的CLC成分具有血管生成特征和更多的肿瘤血管
为了更深入了解CLC(+) iCCA中CLC成分的特征，比较了CLC(+)G1和CLC(?)G1的基因富集情况。GSEA分析表明，CLC(+)G1在细胞极性、纤维基质和血管生成相关基因特征上富集程度更高。组织病理学评估显示，CLC(+) iCCA中的小血管数量显著高于CLC(?) iCCA，尤其是在CLC成分中，其次是非CLC区域。不成对动脉的数量也呈现类似趋势。在iCCA-G1和iCCA-G2之间比较，iCCA-G1中的小血管和不成对动脉数量均显著更高。有趣的是，CLC成分中残留的门脉区数量显著高于CLC(+) iCCA的非CLC区域。
CLC(+) iCCA具有独特的骨桥蛋白表达模式
考虑到常规临床实践中进行全转录组测序和血管计数的困难，本研究旨在通过免疫组化分析鉴定CLC(+) iCCA的关键基因/蛋白，以促进研究发现向临床转化。通过取三个基因集的交集：本队列中CLC(+) iCCA高表达的基因、Andersen I类基因集以及MSigDB中血管生成相关的标志性基因集，鉴定出编码骨桥蛋白的SPP1基因是CLC(+) iCCA的一个关键因子。免疫组化染色分析显示，iCCA肿瘤细胞表现出三种明显模式：顶膜模式（肿瘤导管腔侧阳性）、胞质模式（肿瘤细胞胞质阳性）和阴性。阳性的顶膜模式和胞质模式在CLC(+) iCCA中比在CLC(?) iCCA中更常见，在iCCA-G1中也比在iCCA-G2中更常见。骨桥蛋白阳性模式区分iCCA-G1和iCCA-G2的敏感性和特异性分别为94.4%和100%。此外，顶膜模式在CLC(+) iCCA中更常见，且特异性存在于CLC成分中。在验证队列中，所有具有CLC成分的MF-iCCA病例骨桥蛋白均为阳性，且骨桥蛋白免疫反应性能够对患者预后进行分层。
讨论
本研究全面阐明了具有CLC成分的iCCA的临床、形态学和遗传学特征之间的关系，并开发了基于CLC成分存在的小胆管iCCA分子亚型分类（iCCA-G1和iCCA-G2）。转录组分析显示，CLC(+) iCCA与侵袭性较低的特征相关，如细胞增殖相关基因和DNA修复/合成基因特征的富集较少，这解释了CLC(+) iCCA和iCCA-G1肿瘤患者总生存期更长的原因。各亚组遗传改变的研究表明，TP53和KRAS突变是iCCA-G2中常见的驱动基因改变，这可以解释iCCA-G2的侵袭性生物学表型。重要的是，尽管CLC(+) iCCA和iCCA-G1的总生存期优于CLC(?) iCCA和iCCA-G2，但它们仍有不可忽视的复发风险。考虑到CLC(+)/iCCA-G1和CLC(?)/iCCA-G2之间的遗传差异，针对这些亚组的最佳治疗方法可能不同。值得注意的是，FGFR2和IDH1异常主要出现在iCCA-G1中，二者都可能成为治疗靶点。
关于iCCA-G1是否能进展为iCCA-G2的问题仍未解决，但数据显示iCCA-G1和iCCA-G2之间的几种基因改变是互斥的，而CLC(+)G1和CLC(?)G1共享几种基因改变。同时，CLC和非CLC成分在形态上常呈现连续的过渡。与此一致，骨桥蛋白免疫染色显示，从CLC成分的顶膜模式，到非CLC区域的顶膜-胞质混合模式，最终到胞质模式，呈现渐变趋势。这些发现表明，两个不同的遗传亚组iCCA-G1和iCCA-G2相互转化的可能性较小，而CLC(+)G1和CLC(?)G1可能是连续实体，CLC(?)G1可能起源于CLC(+)G1。
对肿瘤血管和门脉区的组织学评估显示，CLC(+) iCCA和iCCA-G1中的小血管和不成对动脉数量更多。考虑到CLC(+) iCCA和iCCA-G1中需氧代谢的激活，这些亚组中的血管对于为肿瘤细胞提供充足氧气是必要的。相比之下，CLC(?) iCCA和iCCA-G2中缺氧/糖代谢的激活表明，这些亚组的肿瘤可以在血管较少、氧气供应较低的情况下存活。虽然血管生成通常随着恶性肿瘤的进展而增加，但有趣的是iCCA表现出不同的模式。与iCCA-G2相比，iCCA-G1的血管生成可能更接近肝细胞癌的表现，后者以显著的血管生成为人所知。此外，观察到CLC成分中门脉区数量与小血管数量呈负相关趋势。这表明CLC成分在侵袭肝实质时，最初可能保留了肝脏的原始门脉结构，但随着血管生成激活和细胞极性丧失而变得更具侵袭性，破坏了门脉结构。这种情况与一些认为高血管iCCA是iCCA早期阶段的研究一致。
基于研究发现，我们建议利用骨桥蛋白的免疫组化评估来识别预后更好的iCCA亚组。骨桥蛋白在iCCA中持续过表达已有报道，其表达降低与肿瘤侵袭性和临床结局相关。最近对iCCA的单细胞分析也表明，SPP1是外周小胆管iCCA的标志物，并与CLC特征相关。本研究为iCCA中骨桥蛋白的表达模式增添了新见解，发现了iCCA-G1肿瘤CLC区域的顶膜骨桥蛋白模式和非CLC区域的胞质骨桥蛋白模式。这些模式可能预示着CLC在iCCA-G1中向非CLC进展时伴随的细胞极性减弱。此外，骨桥蛋白染色可以作为一种通过顶膜模式识别CLC成分，同时通过其胞质模式识别CLC(?) iCCA中预后更好亚组的新方法。与基于多基因评估相比，免疫染色是一种成本更低的方法，因此骨桥蛋白染色可以很容易地在临床环境中用于MF-iCCA的分子分类。由于许多基因改变和遗传通路与我们的分子分型相关，未来这种分型可用于指导最合适的分子/通路靶向治疗。
本研究使用了来自另一机构的队列和公开数据集进行验证，以弥补样本量有限的不足，但相对较小的样本量仍然是一个重要的局限性。此外，转录组分析使用的是从大块组织中提取的RNA。由于大块标本包含肿瘤细胞、炎症细胞和基质细胞等异质细胞类型的混合物，肿瘤来源的RNA在总RNA中的比例可能因样本而异。本研究中主要比较组之间未观察到肿瘤细胞含量的显著差异，这表明肿瘤细胞比例的影响可能有限。尽管如此，进一步积累iCCA的单细胞转录组数据将有助于更精确地描绘各组的生物学特征。
结论
本研究发现，具有CLC成分的iCCA是预后更好的MF-iCCA的一个组织学亚型。这些组织学亚型所指示的遗传亚组被证明是MF-iCCA的不同分子亚组。对预后较好的遗传亚组（iCCA-G1）中CLC(?)病灶生物学意义的探讨，揭示了MF-iCCA不同的致癌通路。此外，我们建议利用骨桥蛋白染色来识别这些分子亚组。
