《Cancer Science》：Single-Cell Analysis Identified a Recurrent Malignant-Associated Transcriptional State in Colorectal Cancer
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这篇综述通过对四名日本结直肠癌（CRC）患者的肿瘤及癌旁组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），识别出一个在所有病例中均存在的、以长链非编码RNA KCNQ1OT1高表达为特征的恶性肿瘤相关细胞簇。研究进一步发现，尽管临床数据显示RASSF6高表达与西方患者较差总生存期（OS）相关，但在该簇内RASSF6表达显著降低，并且通过公共数据库验证了RASSF6在东亚人群肿瘤组织中一致性下调。本研究凸显了单细胞分析在揭示结直肠癌分子异质性和人群特异性分子特征方面的独特价值。
引言：揭示结直肠癌分子异质性与人群特异性研究的必要性
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症和第二大癌症相关死因。尽管全基因组关联研究（GWAS）和多基因风险评分（PRS）模型加深了我们对日本人群CRC遗传易感性的理解，但关于肿瘤与正常组织之间的转录组差异或复发性癌症相关转录状态等肿瘤生物学特征，在日本患者中仍待探索。这些特征可能与西方人群队列中观察到的情况有所不同。本研究旨在通过单细胞RNA测序（scRNA-seq），对来自日本CRC患者的配对肿瘤和癌旁组织进行分析，以揭示潜在的、人群特异性的癌症相关细胞状态。
材料与方法：日本CRC患者队列的单细胞测序与数据分析
本研究纳入了四名在日本国立癌症研究中心东院接受手术切除的日本CRC患者。所有肿瘤均为中分化管状腺癌，位于乙状结肠或直肠。研究人员获取了患者的肿瘤组织和癌旁正常结肠组织。单细胞悬液制备后，使用10x Genomics Chromium平台构建scRNA-seq文库，并在Illumina测序仪上进行测序。原始数据处理使用Cell Ranger流程，多样本整合使用Cell Ranger Aggr进行深度标准化。后续的聚类、UMAP可视化、差异表达分析和轨迹推断等主要使用Loupe Browser和Monocle3等工具完成。此外，利用cBioPortal和KM plotter等公开数据库，对鉴定出的患者特异性或簇特异性基因集进行了总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）的生存分析。统计分析在R语言环境中完成。
结果
3.1 结直肠癌组织中常见癌细胞状态的鉴定
研究人员从四个CRC样本中获得了59,529个高质量细胞。UMAP分析将整合后的细胞分为41个簇。与癌旁正常部位相比，癌症部位的细胞表现出明显的异质性。癌细胞簇中，肠上皮细胞和杯状细胞群体减少，而调节性T细胞、单核细胞和干细胞样细胞增加。
为了探究癌细胞特异性特征，研究人员对来自四个肿瘤部位的细胞进行了重新聚类，最终识别出一个在所有四个病例中均观察到的、共有的癌症相关细胞簇。对该共有簇的进一步细分，鉴定出五个细胞群体，其中包括KCNQ1OT1高表达的癌细胞。在KCNQ1OT1高表达癌细胞簇中高表达的前五个基因里，只有KCNQ1OT1与较短的PFS相关，提示其潜在的预后价值。
3.2 对患者#4的详细单细胞分析揭示了与较短PFS相关的癌症相关转录状态
研究人员对患者#4（其癌细胞在KCNQ1OT1高表达癌症相关转录状态中占主导）进行了独立、详细的分析。在其癌旁正常组织中，也鉴定出一个转录特征与肿瘤细胞相似的“癌细胞-2”簇，提示可能存在早期的肿瘤相关转录改变。KCNQ1OT1表达特异性地富集在癌症部位，在癌旁正常区域几乎不存在。对KCNQ1OT1高表达簇的进一步细分，鉴定出六个亚簇，其中HOXD9高表达和PROM1高表达簇与较长的OS相关。HOXD9高表达细胞还表现出叉头盒Q1（FOXQ1）、Hes家族bHLH转录因子1（HES1）、Ras关联域家族成员6（RASSF6）和KCNQ1OT1的表达升高，这些基因均与CRC患者较长的OS相关。值得注意的是，对患者#4组织的变异分析发现，RASSF6在外显子1存在体细胞单核苷酸变异（SNV），提示其突变可能在CRC进展中扮演角色。
3.3 利用外部批量RNA测序数据集验证候选生物标志物基因
为了验证scRNA-seq分析中鉴定出的候选基因，研究人员首先对四名患者的细胞进行了伪批量分析。在选定的基因中，RASSF6在癌组织中的表达显著低于正常组织，而HES1的表达则较高。随后，利用公开的批量RNA测序数据集（GSE142279, GSE156451, GSE158559）进行验证。分析证实，KCNQ1OT1、FOXQ1和HES1在肿瘤组织中持续上调，而RASSF6则在肿瘤样本中呈现一致的下调趋势。在转移背景下，只有HOXD9和RASSF6在肝转移灶中相较于原发肿瘤和癌旁正常组织显著下调。利用独立的韩国CRC队列进行的分期特异性表达分析显示，这些基因的表达与CRC分期进展没有明确的关联。
讨论
本研究通过对日本CRC患者的scRNA-seq分析，揭示了一个在所有病例中复现的癌症相关转录状态。重点分析确定了五个代表性基因：KCNQ1OT1、FOXQ1、HES1、HOXD9和RASSF6，它们富集于特定的癌症相关细胞状态，并与本数据集及公共数据中的临床结局相关特征相关联。
KCNQ1OT1作为一种促癌长链非编码RNA，在本研究中高表达于预后较差的患者#4的肿瘤中，与先前在东亚队列中的报道一致。FOXQ1是一个促癌转录因子，在本研究和公共数据中均显示在肿瘤部位上调，可能是一个跨队列广泛适用的CRC生物标志物。HES1是Notch信号通路的下游效应因子，在本队列中其表达在癌旁正常、原发灶和转移灶之间无差异，提示其作用可能具有环境依赖性。
最有趣的发现涉及RASSF6。尽管对TCGA（主要为西方人群）的分析表明较高的RASSF6表达与较差的OS相关，但本研究在单细胞分辨率下发现，RASSF6在癌细胞簇中的表达持续低于癌旁正常组织。这一趋势在独立东亚队列的批量RNA测序数据中也得到验证，显示RASSF6在肿瘤组织中一致下调。先前的研究支持RASSF6的肿瘤抑制功能。本研究的突变分析还发现了肿瘤特异性的RASSF6外显子1SNV。这种差异可能反映了人群间遗传或表观遗传调控的特异性，也凸显了单细胞转录组分析在揭示被批量组织分析所掩盖的癌细胞内在改变方面的价值。
总之，本研究结果证明了RASSF6在本研究队列中的一致性下调，并伴有突变证据，强调了单细胞转录组学在揭示细胞状态特异性分子改变方面的重要性。RASSF6可能代表一个有前景的生物标志物候选，值得在独立队列中进一步验证。
