《Environmental Microbiology Reports》：Spatial Patterns and Overlap of Sedimentary and Rhizosphere Microbiomes of the Seagrass Zostera capensis
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本研究首次对南非濒危海草Cape-Dwarf eelgrass (Zostera capensis) 的沉积物和根际微生物组进行了空间尺度的系统性表征。通过16S rRNA基因扩增子测序，作者发现尽管微生物群落存在显著的空间（河口间与河口内）异质性，但沉积物和根际共享一个主要由硫氧化/还原细菌（SOB/SRB）、有机质降解类群等组成的潜在核心微生物组。功能预测表明，根际微生物组富含对宿主有益的氮、硫循环和有机碳降解等代谢通路。这项工作为理解海草与微生物的共生关系（“全息体”Holobiont）提供了基线数据，支持将微生物群落作为海草生态系统健康和恢复力的潜在生物标志物。
引言：海草、微生物组与全息体
海草是完全适应海洋环境的开花植物，是重要的生态系统工程师，能提供广泛的生态系统服务，并因其碳封存潜力而被视为基于自然的气候变化减缓方案。然而，海草生态系统的功能与其输送服务的能力，与其相关微生物群落的结构和功能密切相关。海草沉积物及其相关的微观环境（如根际）是重要的生态微生境，可以容纳对海草健康和功能至关重要的微生物类群。海草及其相关微生物群落被视为一个“超级有机体”，即海草全息体。理解宿主-微生物组关联的一个关键问题是，在不同宿主之间是否存在共享的“核心”类群或功能。在微观环境中，根际是海草与沉积物之间的界面，可能是研究全息体框架以及了解海草生长和生存的重要微生境。
本研究聚焦于非洲特有的濒危海草物种——Cape-Dwarf eelgrass (Zostera capensis)。在南非，Z. capensis栖息地分布在沿海约3000公里的庇护性河口。本研究旨在表征Z. capensis沉积物和根际微生物组的空间变异，通过检查河口间和河口内的微生物群落变异性，同时考虑水体中的群落，确定可能与Z. capensis沉积物相关的潜在核心微生物组，并在一个河口内识别根际核心微生物组。
实验流程
研究地点与采样
样品于2023年2月至6月期间在南非的三个河口采集：Olifants、Breede和Mngazana。沉积物和水样在三个河口的三个采样点采集。此外，在Olifants河口的Z. capensis草甸还采集了根际样品。沉积物样品使用无菌注射器从海草草甸中采集1-5厘米深度的沉积物。水样通过0.22微米滤膜过滤收集。在Olifants河口，通过挖掘收集附有根系的根茎以获得根际样品。
微生物DNA提取与测序
使用商业试剂盒分别从沉积物、根际沉积物和滤膜上提取DNA。提取的DNA送至华大基因进行PCR扩增和测序。使用针对16S rRNA基因V4区的通用引物515F/806R进行扩增，并在DNBSEQ平台上进行测序。
序列数据处理
使用QIIME2和DADA2流程对原始序列进行处理，生成扩增子序列变体（ASV）。使用基于SILVA数据库的分类器为ASV分配分类学信息。去除叶绿体、线粒体和真核生物相关的ASV，并使用decontam包基于空白对照进行污染物校正。
沉积物和根际核心微生物组的识别
使用microbiome R包的core_members功能识别核心属。对于沉积物核心属，使用三个河口的所有沉积物样品，检测阈值设为0，流行率设为0.89。对于根际核心属，仅使用Olifants河口的样品。核心属被定义为那些在其他来源（如水体）中未检测到的属。
沉积物和根际微生物群落的功能预测
使用PICRUSt2软件基于MetaCyc代谢途径数据库预测微生物群落的潜在功能。然后使用LinDA方法测试Olifants河口沉积物和根际样品之间预测途径的差异丰度。
统计分析
使用Kruskal-Wallis检验和事后Dunn检验比较α多样性（观测ASV数和香农指数）。使用基于Bray-Curtis、非加权和加权UniFrac距离矩阵的PERMANOVA分析β多样性。使用DESeq2包进行差异丰度分析，识别根际和沉积物之间差异显著的ASV。
结果
微生物序列数据与分类学分配
经过质控和分类学分配后，共获得35,901个ASV，其中94.9%被归类为细菌，5%为古菌，88.1%在属水平上得到分类。
沉积物和根际微生物群落结构
微生物群落的相对丰度和流行率在水体、沉积物和根际之间以及不同采样点之间存在差异。根际微生物组由70个门组成，而水体和沉积物分别为57和76个门。沉积物中最丰富的门是变形菌门（Proteobacteria， 25.8%）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota， 16.2%）和绿弯菌门（Chloroflexi， 10.8%）。Olifants河口的根际微生物组以变形菌门（27.6%）、脱硫杆菌门（25.2%）和拟杆菌门（Bacteroidota， 11.3%）为主。在属水平上，沉积物和根际中最常检测到的属包括Woeseia、Rhodopirellula、Desulfosarcina和Halioglobus。
α多样性
沉积物样品α多样性比较显示，三个河口在观测ASV数上存在显著差异。在河口内，仅在Breede河口的观测ASV数以及Breede和Mngazana河口的香农指数显示出显著的站点间差异。在Olifants河口，不同来源（水体、沉积物、根际）在观测ASV数和香农指数上均存在显著差异，根际与沉积物之间的观测ASV数存在显著差异。
β多样性
PERMANOVA分析显示，三个河口之间的沉积物微生物群落在三种距离矩阵下均存在显著差异。在河口内，所有河口的沉积物微生物群落组成均存在显著的河口内空间变异性。在Olifants河口，沉积物和根际微生物群落仅在非加权UniFrac距离矩阵下的成对比较中显示出显著差异。
核心微生物组与差异丰度类群
在考虑了来自水体的微生物类群后，研究识别出一个由18个属组成的潜在沉积物核心微生物组，这些属在三个河口共享。同时，识别出一个由15个属组成的潜在根际核心微生物组。差异丰度分析发现，Olifants河口的沉积物和根际之间有20个ASV（跨越8个门）存在差异丰度。在根际中显著富集的类群包括Pseudoalteromonas、Pseudomonas、Candidatus Thiodiazotropha等。
微生物群落的预测功能
预测功能分析显示，Z. capensis根际与沉积物微生物群落之间有110条MetaCyc途径存在显著差异丰度。根际中富集的途径包括硫相关途径（如硫糖酵解、硫酸盐同化和半胱氨酸生物合成超级途径、硫酸盐还原I）、甲烷相关途径（如产甲烷和乙酸产甲烷超级途径）、氮相关途径（如硝化菌反硝化、硝酸盐还原I（反硝化）和尿素循环）以及有机碳降解相关途径等。
讨论
南非河口微生物群落在不同空间尺度上存在差异
对Z. capensis沉积物微生物组的分析揭示了，沿着海岸线明显的冷暖环境梯度，三个河口的河口内和河口间微生物多样性存在差异。α多样性分析表明，分类学丰富度和均匀度可能分别驱动了河口间和河口内的显著差异。β多样性分析中，采样点和河口的样品在主坐标分析中表现出聚类，表明每个采样位置都具有独特的环境微生物特征。这与之前的研究一致，即南非沿海的生物地理边界塑造了后生动物、原生生物和细菌的多样性。显著的微生物群落空间变异性支持了将微生物群落用作局部环境指标，并具有强大的生物监测潜力。
Z. capensis的根际微生物组与沉积物中的微生物群落不同
在Olifants河口，根际、沉积物和水体微生物组之间检测到细微差异，α和β多样性指标均显示出显著变异性。根际和沉积物在群落结构上的差异进一步得到了差异丰度类群检测的支持。这些差异反映了不同的环境条件：根际富含氧气和有机质，有利于拟杆菌门；而沉积物通常厌氧且富含有机质，有利于绿弯菌门。研究还显示沉积物中的微生物丰富度显著高于根际，这与根际对微生物多样性具有选择作用的假说一致。在属水平上，硫酸盐还原菌Desulfosarcina在根际占主导地位，而硫氧化菌Woeseia在沉积物中最普遍。这些发现表明，与其他海草类似，Z. capensis可以塑造其相关的微生物群落。
Z. capensis相关沉积物和根际的潜在核心微生物组
采用基于丰度和流行率的保守方法，在考虑了来自水体的类群后，识别出一个由18个属组成的核心沉积物微生物组，这些属在三个河口的采样点共享。其中包括与碳氮生物地球化学循环相关的古菌谱系Bathyarchaeia、对氮循环和土壤健康重要的芽孢杆菌属（Bacillus）、以及硫氧化细菌Candidatus Thiobios。此外，还包括多个未培养或未表征的属，如与有机质降解相关的酸杆菌门（Acidobacteria）的若干亚群。
对于根际，识别出的核心微生物组包括硫酸盐还原菌Desulfonema（与受胁迫海草相关，可作为生态指标）、硫氧化菌Thiogranum（有助于降低沉积物中有毒H2S浓度），以及参与有机质降解的Ornatilinea等。识别出的许多根际核心属是未培养或未表征的，这表明对南部非洲沿海微生物组的认识尚处于起步阶段，需要更新参考数据库。
海草相关微生物群落的潜在功能
功能预测分析发现，根际微生物组富含氮、硫循环和有机碳降解等相关途径。氮相关途径的存在与海草根际中存在固氮细菌和古菌的报道一致，这些氮转化过程对海草生长至关重要。硫代谢对海草同样重要，因为其沉积物中可能存在有毒的H2S水平，硫氧化细菌的活动有助于降低其浓度。研究还发现了与产甲烷相关的途径，这对于了解海草草甸的甲烷通量及其对气候变化的影响至关重要。此外，有机质降解途径的识别表明这些微生物可能通过增强沉积物中有机碳的保存，在海草草甸的碳循环和“蓝碳”封存中发挥作用。在根际微生物组中识别出的这些途径，与之前描述的构成海草全息体特征的共生关系中的营养交换和相互作用是一致的。然而，PICRUSt2分析仅限于推断代谢功能，未来的研究需要结合宏基因组学、宏转录组学或培养实验来验证这些预测功能，并探究它们如何构成海草宿主与其根际微生物组之间共生关系的基础。
结论
本研究发现，濒危海草Zostera capensis的沉积物和根际蕴藏着独特的微生物类群。微生物组成在采样河口之间存在显著差异，表明局部环境条件和更广泛的河口特异性因素共同塑造了Z. capensis沉积物微生物群落结构。此外，本研究首次表征了Z. capensis根际的微生物群落及其潜在核心微生物组。这些核心类群代表了Z. capensis全息体的潜在成员，并可能是帮助恢复这种生态意义重大但高度受威胁的海草物种的候选者。尽管我们的发现仅基于16S rRNA基因扩增子测序，功能推断有限，且缺乏环境参数数据，解释需谨慎，但我们的数据支持了日益被认可的观点，即海草沉积物和根际的微生物群落可用于监测这些日益重要的生态系统。
